| 中文摘要 | 第11-14页 |
| Abstract | 第14-16页 |
| 1 前言 | 第17-25页 |
| 1.1 HBV的生物学特性 | 第17-18页 |
| 1.2 HBV基因突变与HCC的关系 | 第18-23页 |
| 1.2.1 X区基因突变与HCC的关系 | 第18-20页 |
| 1.2.2 前C/C区基因突变与HCC的关系 | 第20-21页 |
| 1.2.3 前S/S区基因突变与HCC的关系 | 第21-23页 |
| 1.3 HBV基因突变与HCC关系研究中存在的问题 | 第23-25页 |
| 1.3.1 研究中存在的问题 | 第23-24页 |
| 1.3.2 本研究的目的和意义 | 第24-25页 |
| 2 材料与方法 | 第25-52页 |
| 2.1 材料 | 第25-30页 |
| 2.1.1 细胞系 | 第25页 |
| 2.1.2 质粒 | 第25页 |
| 2.1.3 细胞培养试剂 | 第25页 |
| 2.1.4 细胞检测相关试剂 | 第25页 |
| 2.1.5 RNA提取和逆转录试剂 | 第25-26页 |
| 2.1.6 PCR相关试剂 | 第26页 |
| 2.1.7 荧光定量PCR相关试剂 | 第26页 |
| 2.1.8 载体构建相关试剂 | 第26页 |
| 2.1.9 Western blot相关试剂 | 第26-27页 |
| 2.1.10 试剂的配制 | 第27页 |
| 2.1.11 实验仪器 | 第27-28页 |
| 2.1.12 引物 | 第28-30页 |
| 2.2 技术路线图 | 第30-31页 |
| 2.3 方法 | 第31-52页 |
| 2.3.1 HCC患者的肝癌及癌旁组织基因组的提取 | 第31页 |
| 2.3.2 滚环扩增 | 第31-33页 |
| 2.3.2.1 PSAD酶消化 | 第31页 |
| 2.3.2.2 引物预结合 | 第31-32页 |
| 2.3.2.3 滚环复制 | 第32-33页 |
| 2.3.3 HBV cccDNA和 β-actin检测标准曲线的建立 | 第33-35页 |
| 2.3.3.1 制备标准母液 | 第33页 |
| 2.3.3.2 制备标准工作液 | 第33页 |
| 2.3.3.3 HBV cccDNA和 β-actin的定量检测引物 | 第33-34页 |
| 2.3.3.4 制备标准曲线 | 第34-35页 |
| 2.3.4 HBV cccDNA全基因组PCR测序 | 第35页 |
| 2.3.4.1 PCR扩增HBV cccDNA全基因组 | 第35页 |
| 2.3.4.2 生物信息学分析 | 第35页 |
| 2.3.5 HBV cccDNA全基因组克隆测序 | 第35页 |
| 2.3.5.1 PCR扩增目的片段 | 第35页 |
| 2.3.6 测序结果分析 | 第35-36页 |
| 2.3.7 基因快速突变方法 | 第36-37页 |
| 2.3.7.1 快速突变PCR扩增 | 第36页 |
| 2.3.7.2 DpnI酶切 | 第36页 |
| 2.3.7.3 转化 | 第36-37页 |
| 2.3.7.4 克隆鉴定 | 第37页 |
| 2.3.8 双荧光素酶Luciferase质粒构建 | 第37-41页 |
| 2.3.8.1 引物设计 | 第37页 |
| 2.3.8.2 PCR扩增目的片段 | 第37-38页 |
| 2.3.8.3 目的片段凝胶回收 | 第38-39页 |
| 2.3.8.4 目的片段与pEAZY-Blunt载体分别进行连接 | 第39页 |
| 2.3.8.5 转化 | 第39页 |
| 2.3.8.6 菌液PCR鉴定 | 第39页 |
| 2.3.8.7 挑选PCR鉴定阳性菌液送测序 | 第39页 |
| 2.3.8.8 将阳性菌扩大培养并提取质粒 | 第39-40页 |
| 2.3.8.9 双酶切 | 第40-41页 |
| 2.3.8.10 连接 | 第41页 |
| 2.3.8.11 重组质粒的鉴定 | 第41页 |
| 2.3.9 p Lex-HNF3β-flag表达载体的构建 | 第41-43页 |
| 2.3.9.1 HNF3β目的片段的overlap引物设计 | 第41-42页 |
| 2.3.9.2 分别扩增HNF3β大小两个片段 | 第42-43页 |
| 2.3.9.3 目的片段凝胶回收 | 第43页 |
| 2.3.9.4 连接两个片段 | 第43页 |
| 2.3.10 细胞培养 | 第43-45页 |
| 2.3.10.1 冻存细胞的复苏 | 第43-44页 |
| 2.3.10.2 细胞传代（贴壁细胞） | 第44页 |
| 2.3.10.3 细胞转染（脂质体转染法） | 第44-45页 |
| 2.3.11 RNA的提取和逆转录 | 第45-46页 |
| 2.3.11.1 RNA的提取 | 第45页 |
| 2.3.11.2 逆转录 | 第45-46页 |
| 2.3.12 细胞培养上清中HBV DNA提取 | 第46页 |
| 2.3.13 实时荧光定量PCR法（SYBR Green法） | 第46-47页 |
| 2.3.13.1 实时荧光定量PCR法检测上清中的total DNA、细胞内3.5kb RNA和totalRNA | 第46-47页 |
| 2.3.14 时间分辨荧光法检测HBeAg | 第47页 |
| 2.3.15 时间分辨荧光法检测HBsAg | 第47-48页 |
| 2.3.16 Western blot蛋白印迹实验 | 第48-49页 |
| 2.3.16.1 提取细胞总蛋白 | 第48页 |
| 2.3.16.2 蛋白样品变性 | 第48页 |
| 2.3.16.3 SDS-PAGE电泳 | 第48-49页 |
| 2.3.17 染色质免疫沉淀实验 | 第49-51页 |
| 2.3.17.1 染色质免疫沉淀 | 第49-50页 |
| 2.3.17.2 DNA纯化 | 第50页 |
| 2.3.17.3 PCR检测 | 第50-51页 |
| 2.3.18 T1719G突变后HBV Enh II活性的双荧光检测 | 第51-52页 |
| 2.3.18.1 细胞转染 | 第51页 |
| 2.3.18.2 Luciferase活性测定 | 第51-52页 |
| 3 结果与分析 | 第52-83页 |
| 3.1 HCC患者肝癌与癌旁组织中HBV cccDNA突变位点的筛选 | 第52-71页 |
| 3.1.1 肝细胞癌患者临床信息 | 第52-53页 |
| 3.1.2 HCC患者癌与癌旁组织中HBV cccDNA与HBV total DNA定量结果 | 第53-55页 |
| 3.1.3 HBV cccDNA全基因组突变位点 | 第55-62页 |
| 3.1.4 HCC患者的癌与癌旁组织中HBV cccDNA突变频数的比较 | 第62页 |
| 3.1.5 HBV cccDNA突变位点与HBV cccDNA和total DNA定量结果的比较 | 第62-63页 |
| 3.1.6 HBV cccDNA突变位点、突变率及HBV cccDNA/total DNA比值的生存时间分析 | 第63-65页 |
| 3.1.7 HBV cccDNA突变位点与临床资料之间的关系 | 第65-66页 |
| 3.1.8 HCC患者癌与癌旁组织中HBV cccDNA氨基酸突变特点 | 第66-69页 |
| 3.1.9 癌组织与癌旁组织HBV cccDNA的克隆测序 | 第69-71页 |
| 3.2 G588C突变位点的功能研究 | 第71-73页 |
| 3.2.1 G588C突变位点的确定 | 第71页 |
| 3.2.2 G588C定点突变结果 | 第71-72页 |
| 3.2.3 G588C突变降低HBsAg的分泌 | 第72-73页 |
| 3.2.4 G588C突变没有改变HBV的复制能力 | 第73页 |
| 3.3 T1719G突变位点的功能研究 | 第73-83页 |
| 3.3.1 HCC患者癌组织中HBV cccDNA测序结果 | 第74页 |
| 3.3.2 HBV1.2×-T1719G突变质粒的构建 | 第74-75页 |
| 3.3.3 HBV1.2×-T1719G突变的功能检测 | 第75-77页 |
| 3.3.3.1 HBV的T1719G突变降低了HBsAg和HBeAg的表达 | 第75-76页 |
| 3.3.3.2 T1719G突变影响了HBV的复制能力 | 第76-77页 |
| 3.3.4 p Lex-HNF3β载体的构建与表达 | 第77-79页 |
| 3.3.4.1 p Lex-HNF3β载体的构建 | 第77-78页 |
| 3.3.4.2 p Lex-HNF3β载体的表达 | 第78-79页 |
| 3.3.5 T1719G突变可下调HBV Enh II的活性 | 第79-80页 |
| 3.3.6 Ch IP-PCR实验证实T1719G突变减弱了转录因子HNF3β与HBV EnhII之间的结合力 | 第80-81页 |
| 3.3.7 HBx在T1719G突变引起的细胞上清中HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平降低中起到了重要的作用 | 第81-83页 |
| 4 讨论 | 第83-94页 |
| 4.1 HCC患者肝癌与癌旁组织中HBV cccDNA突变位点的筛选 | 第83-88页 |
| 4.2 G588C突变位点的功能研究 | 第88-89页 |
| 4.3 T1719G突变位点的功能研究 | 第89-94页 |
| 5 结论 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-111页 |
| 致谢 | 第111-112页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第112页 |
