| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-23页 |
| 1 贻贝粘蛋白的研究进展 | 第12-23页 |
| 1.1 贻贝粘蛋白的概述 | 第12页 |
| 1.2 贻贝足丝的结构、组成以及功能 | 第12-16页 |
| 1.3 粘蛋白的粘附机理 | 第16-18页 |
| 1.3.1 DOPA的作用 | 第16-17页 |
| 1.3.2 贻贝足丝盘粘附的过程及机理 | 第17-18页 |
| 1.4 贻贝粘蛋白的应用 | 第18-19页 |
| 1.4.1 生物医学粘合剂 | 第18页 |
| 1.4.2 涂层和保护膜 | 第18-19页 |
| 1.4.3 仿生组织粘合剂 | 第19页 |
| 1.5 贻贝粘蛋白获取途径 | 第19-20页 |
| 1.6 植物生物反应器表达外源蛋白的研究概况 | 第20-21页 |
| 1.7 立题的背景、意义及目的 | 第21-23页 |
| 第二章 Mgfp-5基因植物表达载体构建及转化农杆菌 | 第23-34页 |
| 1 材料 | 第23-25页 |
| 1.1 供试菌株和质粒 | 第23页 |
| 1.2 主要试剂及试剂盒 | 第23页 |
| 1.3 主要试剂的配制 | 第23-25页 |
| 1.3.1 常用抗生素的配制 | 第23-24页 |
| 1.3.2 培养基配制 | 第24页 |
| 1.3.3 大肠杆菌感受态细胞制备试剂 | 第24页 |
| 1.3.4 DNA琼脂糖凝胶电泳所需实验试剂 | 第24页 |
| 1.3.5 农杆菌感受态细胞制备试剂 | 第24-25页 |
| 2 实验方法 | 第25-30页 |
| 2.1 贻贝粘蛋白基因Mgfp-5植物表达载体的构建 | 第25-29页 |
| 2.1.1 Mgfp-5基因植物双元表达载体构建策略 | 第25页 |
| 2.1.2 Mgfp-5基因的获得 | 第25-27页 |
| 2.1.3 pRI101-AN载体的获得 | 第27页 |
| 2.1.4 Mgfp-5基因与pRI101-AN载体的连接 | 第27-28页 |
| 2.1.5 大肠杆菌感受态细胞的制备方法及热激法转化大肠杆菌 | 第28页 |
| 2.1.6 大肠杆菌转化子的鉴定 | 第28-29页 |
| 2.2 植物双元表达载体pRI101-Mgfp导入农杆菌LBA4404 | 第29-30页 |
| 2.2.1 农杆菌感受态细胞的制备方法及冻融法转化农杆菌 | 第29页 |
| 2.2.2 农杆菌转化子的鉴定 | 第29-30页 |
| 3 结果与分析 | 第30-32页 |
| 3.1 贻贝Mgfp-5基因表达载体的构建 | 第30-31页 |
| 3.2 表达载体转入农杆菌的验证 | 第31-32页 |
| 4 小结与讨论 | 第32-34页 |
| 第三章 农杆菌介导的Mgfp-5基因对烟草的遗传转化及转基因植株的鉴定 | 第34-56页 |
| 1 材料 | 第34-37页 |
| 1.1 植物受体材料 | 第34页 |
| 1.2 主要试剂及试剂盒 | 第34-35页 |
| 1.3 主要试剂的配制 | 第35-37页 |
| 1.3.1 抗生素及生长素的配制 | 第35页 |
| 1.3.2 遗传转化中的培养基配制 | 第35页 |
| 1.3.3 CTAB相关试剂 | 第35-36页 |
| 1.3.4 SDS-PAGE凝胶相关试剂 | 第36-37页 |
| 1.3.5 Bradford法测蛋白质浓度相关试剂 | 第37页 |
| 1.3.6 植物蛋白提取相关试剂 | 第37页 |
| 1.3.7 蛋白免疫印迹相关试剂 | 第37页 |
| 2 实验方法 | 第37-46页 |
| 2.1 烟草离体再生体系的建立 | 第37-38页 |
| 2.1.1 植物材料烟草无菌的获得 | 第37页 |
| 2.1.2 不同激素组合对不定芽形成的影响 | 第37-38页 |
| 2.1.3 不同激素组合诱导生根及移栽 | 第38页 |
| 2.2 烟草叶片Kan的敏感性确定 | 第38页 |
| 2.3 农杆菌介导的秦烟95遗传转化体系的建立 | 第38-39页 |
| 2.3.1 农杆菌LBA4404(pRI101-Mgfp)的保存、培养及侵染液的制备 | 第38页 |
| 2.3.2 根癌农杆菌介导法转化程序 | 第38-39页 |
| 2.3.3 影响烟草遗传转化因素的条件优化 | 第39页 |
| 2.4 转化烟草再生植株的获得 | 第39页 |
| 2.5 转基因烟草植株的鉴定 | 第39-46页 |
| 2.5.1 DNA提取 | 第39-40页 |
| 2.5.2 转基因烟草的PCR检测 | 第40-41页 |
| 2.5.3 TRIzol试剂法提取植物总RNA | 第41-42页 |
| 2.5.4 总RNA中基因组DNA的去除 | 第42-43页 |
| 2.5.5 反转录形成cDNA的第一条链 | 第43-44页 |
| 2.5.6 RT-PCR反应 | 第44页 |
| 2.5.7 T_1代转基因植株的获得及转基因植株的鉴定 | 第44页 |
| 2.5.8 在转基因植物中提取总蛋白 | 第44页 |
| 2.5.9 Bradford法蛋白定量 | 第44-45页 |
| 2.5.10 SDS-PAGE凝胶电泳 | 第45页 |
| 2.5.11 Western Blot鉴定 | 第45-46页 |
| 3 结果与分析 | 第46-53页 |
| 3.1 烟草离体再生体系的建立 | 第46-47页 |
| 3.2 受体植物叶片Kan敏感性的确定 | 第47-48页 |
| 3.3 农杆菌介导遗传转化体系的优化 | 第48-50页 |
| 3.3.1 农杆菌的侵染浓度和侵染时间对转化效率的影响 | 第48-49页 |
| 3.3.2 外植体预培养和共培养时间对转化效率的影响 | 第49-50页 |
| 3.4 转Mgfp-5基因再生植株的获得 | 第50页 |
| 3.5 转基因植株的分子生物学鉴定 | 第50-52页 |
| 3.5.1 T_0代转化植株Mgfp-5基因的PCR检测 | 第50-51页 |
| 3.5.2 T_0代转化植株Mgfp-5基因的RT-PCR检测 | 第51-52页 |
| 3.6 T_1代转基因植株的获得及分子生物学鉴定 | 第52-53页 |
| 3.7 SDS-PAGE电泳、Western Blot鉴定蛋白的表达 | 第53页 |
| 4 小结与讨论 | 第53-56页 |
| 结论 | 第56-58页 |
| 参考文献 | 第58-65页 |
| 研究成果 | 第65-66页 |
| 致谢 | 第66页 |
