| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 缩略语对照表 | 第9-17页 |
| 第一章 绪论 | 第17-25页 |
| 1.1 前言 | 第17页 |
| 1.2 bFGF在损伤修复中的作用 | 第17-19页 |
| 1.2.1 bFGF对骨损伤修复的作用 | 第17-18页 |
| 1.2.2 bFGF对软骨损伤修复的作用 | 第18页 |
| 1.2.3 bFGF对皮肤损伤修复的作用 | 第18-19页 |
| 1.2.4 bFGF对神经损伤修复的作用 | 第19页 |
| 1.2.5 bFGF对肌腱损伤修复的作用 | 第19页 |
| 1.3 bFGF在临床应用的主要问题与解决方法 | 第19-21页 |
| 1.3.1 利用吸附作用延长bFGF作用时间 | 第20页 |
| 1.3.2 水凝胶/脂质体包被 | 第20-21页 |
| 1.3.3 共价交联 | 第21页 |
| 1.4 类弹性蛋白 | 第21-23页 |
| 1.4.1 ELPs在组织工程中的应用 | 第21-22页 |
| 1.4.2 ELPs在药物缓释和靶向中的作用 | 第22页 |
| 1.4.3 ELPs作为蛋白质纯化标签的应用 | 第22-23页 |
| 1.4.4 ELPs融合对活性多肽或蛋白质的影响 | 第23页 |
| 1.5 实验目的和设计 | 第23-25页 |
| 第二章 ELP50-bFGF融合蛋白的原核表达载体构建及诱导表达 | 第25-40页 |
| 2.1 实验仪器 | 第25页 |
| 2.2 实验试剂、器材及材料 | 第25-26页 |
| 2.2.1 实验试剂 | 第26页 |
| 2.2.2 实验器材 | 第26页 |
| 2.2.3 菌株及质粒 | 第26页 |
| 2.2.4 实验动物 | 第26页 |
| 2.3 主要试剂配制 | 第26-27页 |
| 2.3.1 100 mg/mL卡那霉素母液 | 第26页 |
| 2.3.2 LB培养基和含有卡那霉素的LB培养基 | 第26-27页 |
| 2.3.3 LB固体培养基和含有卡那霉素的LB固体培养基 | 第27页 |
| 2.3.4 100 mg/mL IPTG母液 | 第27页 |
| 2.3.5 0.1M CaCl_2溶液 | 第27页 |
| 2.3.6 0.05 M碳酸盐缓冲液 | 第27页 |
| 2.3.7 0.15 M PBST | 第27页 |
| 2.3.8 5% BSA | 第27页 |
| 2.3.9 2M H_2SO_4 | 第27页 |
| 2.3.10 膜转移缓冲液 | 第27页 |
| 2.4 实验方法 | 第27-34页 |
| 2.4.1 E.coli Top10、BL21(DE3)感受态细胞制备 | 第28页 |
| 2.4.2 转化 | 第28页 |
| 2.4.3 质粒提取 | 第28页 |
| 2.4.4 酶切 | 第28-30页 |
| 2.4.5 目的片段的切胶回收 | 第30页 |
| 2.4.6 目的片段与载体连接重组及重组子的筛选 | 第30-31页 |
| 2.4.7 pET28a-ELP50和pET28a-ELP50-bFGF转化E.coli BL21(DE3) | 第31页 |
| 2.4.8 pET28a-ELP50和pET28a-ELP50-bFGF的预表达 | 第31-32页 |
| 2.4.9 菌种的保存 | 第32页 |
| 2.4.10 ELP50和ELP50-bFGF的可溶性分析 | 第32页 |
| 2.4.11 免疫家兔 | 第32-33页 |
| 2.4.12 ELISA抗原包被最佳工作浓度的确定 | 第33页 |
| 2.4.13 ELISA测定抗体效价 | 第33页 |
| 2.4.14 Western blotting检测 | 第33-34页 |
| 2.5 实验结果 | 第34-38页 |
| 2.5.1 pMD19-ELP50的构建及酶切检测 | 第34-35页 |
| 2.5.2 pET28a-ELP50及pET28a-ELP50-bFGF质粒的构建及酶切检测 | 第35-36页 |
| 2.5.3 ELP50和ELP50-bFGF在E.coli BL21(DE3)中的表达 | 第36页 |
| 2.5.4 ELP50和ELP50-bFGF的可溶性分析 | 第36页 |
| 2.5.5 抗原包被最佳工作浓度的确定 | 第36-37页 |
| 2.5.6 兔抗血清效价的测定 | 第37页 |
| 2.5.7 Western blotting检测 | 第37-38页 |
| 2.6 小结与讨论 | 第38-40页 |
| 第三章 ELP50和ELP50-bFGF的分离纯化及活性分析 | 第40-52页 |
| 3.1 实验仪器 | 第40页 |
| 3.2 实验试剂、器材 | 第40-41页 |
| 3.2.1 实验试剂 | 第40页 |
| 3.2.2 实验器材 | 第40-41页 |
| 3.3 主要试剂的配制 | 第41-42页 |
| 3.3.1 20 mM Tris-HCl (pH=8.0) | 第41页 |
| 3.3.2 150 mM NaCl | 第41页 |
| 3.3.3 2×YT培养基 | 第41页 |
| 3.3.4 发酵培养基 | 第41页 |
| 3.3.5 补料培养基 | 第41页 |
| 3.3.6 含10%胎牛血清的DMEM完全培养基 | 第41页 |
| 3.3.7 含1%胎牛血清的DMEM维持培养基 | 第41-42页 |
| 3.3.8 PBS | 第42页 |
| 3.4 实验方法 | 第42-46页 |
| 3.4.1 融合蛋白的大规模发酵生产 | 第42页 |
| 3.4.2 破菌和洗涤 | 第42-43页 |
| 3.4.3 纯化 | 第43-44页 |
| 3.4.4 透析除盐 | 第44页 |
| 3.4.5 冻干保存 | 第44-45页 |
| 3.4.6 L929细胞的复苏、传代和冻存 | 第45页 |
| 3.4.7 L929细胞增殖实验 | 第45页 |
| 3.4.8 L929细胞迁移实验 | 第45-46页 |
| 3.5 实验结果 | 第46-50页 |
| 3.5.1 ELP50-bFGF包涵体洗涤 | 第46页 |
| 3.5.2 ELP50色谱纯化 | 第46-47页 |
| 3.5.3 ELP50-bFGF色谱纯化 | 第47页 |
| 3.5.4 ELP50和ELP50-bFGF纯化 | 第47-48页 |
| 3.5.5 ELP50-bFGF对小鼠成纤维细胞增殖能力的影响 | 第48-49页 |
| 3.5.6 ELP50-bFGF对小鼠成迁移能力的影响 | 第49-50页 |
| 3.6 小结与讨论 | 第50-52页 |
| 第四章 类弹性蛋白对小鼠皮肤缺损修复的作用效果 | 第52-63页 |
| 4.1 实验仪器 | 第52页 |
| 4.2 实验试剂、器材及材料 | 第52-53页 |
| 4.2.1 实验试剂 | 第52-53页 |
| 4.2.2 实验器材 | 第53页 |
| 4.2.3 实验材料 | 第53页 |
| 4.2.4 实验动物 | 第53页 |
| 4.3 主要试剂的配制 | 第53-54页 |
| 4.3.1 0.05M Na_2CO_3 | 第53页 |
| 4.3.2 CaCl_2-EtOH-H_2O(物质的量比1：2：8) | 第53页 |
| 4.3.3 LiBr-EtOH-H_2O(质量比45：44：11) | 第53页 |
| 4.3.4 9.3M LiBr | 第53页 |
| 4.3.5 9.09M CaCl_2 | 第53-54页 |
| 4.3.6 4.5M CaCl_2的配制 | 第54页 |
| 4.3.7 Na_2S(脱毛剂)的配制 | 第54页 |
| 4.3.8 戊巴比妥钠溶液的配制 | 第54页 |
| 4.3.9 4%(W/V)多聚甲醛固定液 | 第54页 |
| 4.3.10 伊红染液 | 第54页 |
| 4.3.11 苏木精染液 | 第54页 |
| 4.3.12 1%盐酸酒精分化液 | 第54页 |
| 4.4 实验方法 | 第54-57页 |
| 4.4.1 ELP50及ELP50-bFGF的冻干 | 第55页 |
| 4.4.2 丝素蛋白溶液的制备 | 第55页 |
| 4.4.3 丝素蛋白膜片的制备 | 第55页 |
| 4.4.4 复合bFGF的丝素蛋白膜片的制备 | 第55页 |
| 4.4.5 复合bFGF的丝素蛋白膜片的水溶性分析 | 第55-56页 |
| 4.4.6 傅里叶红外光谱 | 第56页 |
| 4.4.7 拉伸力分析 | 第56页 |
| 4.4.8 昆明小鼠皮肤缺损修复实验 | 第56-57页 |
| 4.4.9 修复面积的统计学分析 | 第57页 |
| 4.4.10 小鼠新生皮肤的石蜡切片及HE染色 | 第57页 |
| 4.5 实验结果 | 第57-62页 |
| 4.5.1 ELP50-bFGF和ELP50冻干的形态观察 | 第58页 |
| 4.5.2 不同溶剂对丝素纤维的溶解效果 | 第58-59页 |
| 4.5.3 冻干丝素蛋白形态的观察 | 第59页 |
| 4.5.4 不同处理丝素蛋白膜片的水溶性 | 第59页 |
| 4.5.5 丝素蛋白膜片的拉伸强度 | 第59-60页 |
| 4.5.6 复合膜片的红外结果 | 第60页 |
| 4.5.7 L929小鼠皮肤缺损修复实验结果 | 第60-61页 |
| 4.5.8 HE染色结果 | 第61-62页 |
| 4.6 小结与讨论 | 第62-63页 |
| 小结 | 第63页 |
| 实验存在的问题及今后的努力方向 | 第63-65页 |
| 参考文献 | 第65-71页 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 | 第71-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
