| 中文摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-10页 |
| 缩写词和英汉对照 | 第10-11页 |
| 引言 | 第11-12页 |
| 第一部分 文献综述 | 第12-24页 |
| 1 果树病毒病特点、危害和种类 | 第12-13页 |
| 2 果树病毒国内外研究现状 | 第13页 |
| 3 葡萄病毒病的研究 | 第13-20页 |
| ·葡萄病毒病发生与危害 | 第13-14页 |
| ·国内外葡萄病毒研究进展 | 第14-15页 |
| ·国外研究进展 | 第14页 |
| ·国内研究进展 | 第14-15页 |
| ·几种重要葡萄病毒病的研究 | 第15-20页 |
| ·葡萄扇叶病 | 第15-16页 |
| ·葡萄卷叶病 | 第16-17页 |
| ·葡萄栓皮病 | 第17页 |
| ·葡萄茎痘病 | 第17-20页 |
| ·葡萄病毒研究展望 | 第20页 |
| ·检测技术研究 | 第20页 |
| ·加快培育或引进无病毒葡萄优良品种 | 第20页 |
| ·标准制定与无病毒苗木繁育体系的建立 | 第20页 |
| 4 原位RT-PCR 技术研究 | 第20-24页 |
| ·原位RT-PCR 的基本原理 | 第21页 |
| ·原位RT-PCR 的基本步骤 | 第21-23页 |
| ·标本制备 | 第21-22页 |
| ·扩增前预处理 | 第22页 |
| ·反转录反应 | 第22页 |
| ·原位PCR 扩增 | 第22页 |
| ·杂交前处理 | 第22页 |
| ·原位杂交检测 | 第22-23页 |
| ·对照的设置 | 第23页 |
| ·原位逆转录PCR 的应用 | 第23-24页 |
| 第二部分 实验内容 | 第24-49页 |
| 1 试验材料和主要试剂仪器 | 第24页 |
| ·供试材料 | 第24页 |
| ·试剂及酶类 | 第24页 |
| ·主要仪器 | 第24页 |
| ·引物设计 | 第24页 |
| 2 试验方法 | 第24-31页 |
| ·常规 RT-PCR 法检测葡萄茎痘病毒 | 第24-27页 |
| ·总 RNA 的提取方法 | 第24-25页 |
| ·cDNA 合成 | 第25页 |
| ·PCR 扩增GRSPaV 特异性片段 | 第25-26页 |
| ·PCR 产物的电泳检测 | 第26页 |
| ·PCR 产物的回收与纯化 | 第26页 |
| ·目的片段的连接、克隆、与鉴定 | 第26-27页 |
| ·石蜡切片的制备 | 第27-28页 |
| ·玻片的清洗和处理 | 第27-28页 |
| ·切片制备材料 | 第28页 |
| ·直接原位RT-PCR 检测体系 | 第28-30页 |
| ·组织预处理 | 第28-29页 |
| ·反转录反应 | 第29页 |
| ·原位PCR 扩增 | 第29页 |
| ·原位PCR 产物的免疫检测 | 第29-30页 |
| ·对照的设置 | 第30页 |
| ·生物素标记探针的制备 | 第30页 |
| ·间接原位RT-PCR 检测体系 | 第30-31页 |
| 3 结果与分析 | 第31-40页 |
| ·常规RT-PCR 检测葡萄茎痘病毒结果 | 第31-34页 |
| ·葡萄枝条与叶片提取的总 RNA 结果 | 第31-32页 |
| ·RT-PCR 检测GRSPaV 的凝胶电泳结果 | 第32页 |
| ·重组质粒的 PCR 鉴定 | 第32-33页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第33页 |
| ·测序结果 | 第33-34页 |
| ·适合于植物组织的石蜡切片的制作 | 第34-35页 |
| ·固定时间的影响 | 第34页 |
| ·脱水时间的影响 | 第34-35页 |
| ·切片厚度的影响 | 第35页 |
| ·生物素标记的CDNA 探针的鉴定 | 第35页 |
| ·切片预处理对结果的影响 | 第35-36页 |
| ·直接原位RT-PCR 检测体系 | 第36-37页 |
| ·葡萄茎尖纵剖切片中葡萄痉痘病毒的检测结果 | 第36页 |
| ·阴性对照和空白对照的设置 | 第36-37页 |
| ·间接原位RT-PCR 检测体系 | 第37-38页 |
| ·葡萄茎尖纵剖切片中葡萄痉痘病毒的检测结果 | 第37页 |
| ·无毒苗茎尖组织的间接原位RT-PCR 检测结果 | 第37-38页 |
| ·空白对照的设置 | 第38页 |
| ·葡萄茎尖横剖连续切片研究病毒在组织体内的分布 | 第38-40页 |
| 4 讨论 | 第40-46页 |
| ·适合于植物茎尖幼嫩组织的石蜡切片的制备 | 第40-41页 |
| ·葡萄茎尖的取材和固定 | 第40页 |
| ·石蜡切片的制备 | 第40-41页 |
| ·玻片的清洗和防脱剂的使用 | 第41页 |
| ·原位RT-PCR 切片预处理 | 第41-42页 |
| ·蛋白酶 K 的作用 | 第41-42页 |
| ·DNA 酶的处理 | 第42页 |
| ·用PCR 法制备生物素标记的CDNA 探针 | 第42-43页 |
| ·生物素标记探针的应用 | 第42-43页 |
| ·探针的长度和浓度 | 第43页 |
| ·降低背景染色的各种处理 | 第43-44页 |
| ·洗涤 | 第43页 |
| ·预杂交 | 第43-44页 |
| ·关于原位RT-PCR 实验中对照的设置 | 第44页 |
| ·直接原位RT-PCR 和间接原位RT-PCR 的比较 | 第44页 |
| ·实验过程中防止反应液的蒸发 | 第44-45页 |
| ·茎尖切片中葡萄茎痘病毒的检测结果讨论 | 第45-46页 |
| 5 结论 | 第46页 |
| 6 创新 | 第46-47页 |
| 7 进一步研究的设想 | 第47-49页 |
| ·对直接原位RT-PCR 和间接原位RT-PCR 体系进行优化 | 第47页 |
| ·进一步运用建立起的原位 RT-PCR 检测体系 | 第47页 |
| ·对特异性杂交信号进行定量分析 | 第47-48页 |
| ·进行荧光原位RT-PCR 的检测 | 第48-49页 |
| 参考文献 | 第49-55页 |
| 附录一 本研究使用的主要试剂与溶液的配制 | 第55-57页 |
| 附表二测序原始图谱 | 第57-58页 |
| 致谢 | 第58-59页 |
| 作者简介 | 第59-60页 |
| 导师评阅表 | 第60页 |