| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-15页 |
| 缩略语 | 第15-16页 |
| 第一部分 文献综述与实验设计 | 第16-25页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-23页 |
| 1. 前言 | 第16-17页 |
| 2. 膜蛋白HW 的相关信息 | 第17-18页 |
| 3. 关于多角体 | 第18页 |
| 4. 原核表达系统 | 第18-19页 |
| 5. 新的Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统 | 第19页 |
| 6. 家蚕生物反应器的应用 | 第19-20页 |
| 7. 膜蛋白的纯化方法 | 第20-21页 |
| 8. 膜蛋白HW 的结构功能分析 | 第21-23页 |
| 第二章 实验设计方案 | 第23-25页 |
| 1. 实验目的和意义 | 第23页 |
| 2. 本实验的主要研究内容 | 第23-24页 |
| 3. 实验技术路线 | 第24-25页 |
| 第二部分 研究论文 | 第25-86页 |
| 第一章 生物信息学分析 | 第25-31页 |
| 1. 生物信息学工具 | 第25-26页 |
| 2. 分析方法 | 第26-27页 |
| ·目的基因HW 的获得 | 第26页 |
| ·利用生物信息学方法分析 | 第26-27页 |
| 3. 分析结果 | 第27-30页 |
| ·家蚕膜蛋白HW 的基因序列 | 第27页 |
| ·保守性分析 | 第27-28页 |
| ·膜蛋白HW 的疏水性分析 | 第28页 |
| ·膜蛋白HW 的跨膜区分析 | 第28-29页 |
| ·信号肽预测 | 第29-30页 |
| ·膜蛋白HW 的亚细胞定位分析 | 第30页 |
| 4. 讨论 | 第30-31页 |
| 第二章 家蚕HW 基因的原核表达 | 第31-49页 |
| 1. 材料与试剂 | 第31-35页 |
| ·材料 | 第31页 |
| ·订购试剂 | 第31-32页 |
| ·自配试剂 | 第32-35页 |
| 2. 方法 | 第35-43页 |
| ·HW 基因的克隆 | 第35-39页 |
| ·特异性引物的设计与合成 | 第36页 |
| ·PCR 扩增 | 第36-37页 |
| ·PCR 产物和pBacPAK8-Ph 载体的双酶切和回收 | 第37页 |
| ·连接反应 | 第37页 |
| ·CaCl_2法制备E.coli TG1 感受态细胞 | 第37-38页 |
| ·连接产物的转化 | 第38页 |
| ·重组pBacPAK8 质粒的筛选与鉴定 | 第38-39页 |
| ·融合基因Ph-HW 的克隆 | 第39-40页 |
| ·融合基因Ph-HW 的回收 | 第39页 |
| ·pET-28a 载体双酶切与回收 | 第39页 |
| ·融合基因与pET-28a 载体的连接和转化 | 第39-40页 |
| ·重组质粒pET-28a-Ph-HW 的筛选与鉴定 | 第40页 |
| ·融合基因Ph-HW 的表达 | 第40-43页 |
| ·CaCl_2法制备E.coli BL21 感受态细胞 | 第40页 |
| ·重组质粒pET-28a-Ph-HW 的筛选 | 第40页 |
| ·His-Ph-HW 融合蛋白在大肠杆菌中的表达 | 第40-41页 |
| ·蛋白凝胶电泳检测 | 第41-42页 |
| ·Western blot鉴定 | 第42-43页 |
| 3. 结果 | 第43-47页 |
| ·PCR 扩增目的基因 | 第43-44页 |
| ·HW 基因PCR 产物双酶切回收与载体pBacPAK8-Ph 的双酶切回收 | 第44页 |
| ·重组质粒pBacPAK8-Ph-HW 的鉴定 | 第44-45页 |
| ·融合基因Ph-HW 的双酶切回收与载体pET-28a 的双酶切回收 | 第45页 |
| ·重组质粒pET-28a-Ph-HW 的鉴定 | 第45-46页 |
| ·His-Ph-HW 融合蛋白的表达 | 第46-47页 |
| ·SDS-PAGE 电泳检测 | 第46-47页 |
| ·Western blot 检测 | 第47页 |
| 4. 讨论 | 第47-49页 |
| 第三章 家蚕融合膜蛋白的纯化与性质分析 | 第49-59页 |
| 1. 材料与试剂 | 第49-51页 |
| ·材料 | 第49页 |
| ·试剂 | 第49页 |
| ·主要试剂的配制 | 第49-51页 |
| ·包涵体洗涤用试剂 | 第49-50页 |
| ·调pH 值的方法纯化融合蛋白所用试剂 | 第50页 |
| ·镍柱亲和层析纯化用试剂 | 第50页 |
| ·SDS-PAGE 电泳用试剂 | 第50-51页 |
| ·Western blot 鉴定试剂的配置 | 第51页 |
| 2. 方法 | 第51-54页 |
| ·融合蛋白表达产物存在形式的检测分析 | 第51页 |
| ·重组蛋白的大量表达与样品制备 | 第51-52页 |
| ·调pH 值的方法纯化融合蛋白 | 第52-53页 |
| ·Ni-NTA 柱纯化融合蛋白 | 第53-54页 |
| ·尿素溶解目的融合蛋白 | 第53页 |
| ·Ni-NTA 柱纯化融合蛋白 | 第53-54页 |
| ·融合蛋白TEV 酶切，去掉多角体 | 第54页 |
| 3. 结果 | 第54-58页 |
| ·融合蛋白表达形式的确定 | 第54-55页 |
| ·调pH 方法纯化融合蛋白结果 | 第55-56页 |
| ·摸索最佳溶解缓冲液pH | 第55-56页 |
| ·调pH 方法纯化结果 | 第56页 |
| ·镍柱亲和层析纯化融合蛋白结果 | 第56-57页 |
| ·目的蛋白HW 的获得 | 第57-58页 |
| 4. 讨论 | 第58-59页 |
| 第四章 家蚕HW 基因的真核表达 | 第59-75页 |
| 1. 材料与试剂 | 第59-61页 |
| ·材料 | 第59-60页 |
| ·订购试剂 | 第60页 |
| ·自配试剂 | 第60-61页 |
| 2. 方法 | 第61-70页 |
| ·Bac-to-Bac(?) System | 第61-62页 |
| ·实验方案设计路线 | 第62-63页 |
| ·构建融合pFastBac~(TM)HTb 质粒 | 第63-65页 |
| ·pFastBac~(TM)HTb 质粒的提取 | 第63页 |
| ·pFastBac~(TM)HTb 质粒的双酶切与回收 | 第63页 |
| ·回收的融合基因与回收的质粒pFastBac~(TM)HTb 的连接反应 | 第63-64页 |
| ·E.coli TG1 感受态细胞的制备（如原核实验部分，略） | 第64页 |
| ·连接产物的转化实验 | 第64页 |
| ·阳性克隆的筛选与鉴定 | 第64-65页 |
| ·重组质粒测序 | 第65页 |
| ·重组BmBacmid-Ph-HW 质粒的构建 | 第65-68页 |
| ·E. coli DH10Bac~(TM)感受态细胞的制备 | 第65-66页 |
| ·重组质粒pFast-Ph-HW 直接转化含有bacmid 质粒E. coli DH10Bac~(TM)感受态细胞 | 第66页 |
| ·重组BmBacmid-Ph-HW 质粒的提取 | 第66-67页 |
| ·BmBacmid-Ph-HW 重组质粒的鉴定（PCR 鉴定） | 第67-68页 |
| ·BmBacmid-Ph-HW 重组质粒转染家蚕细胞 | 第68页 |
| ·收获重组病毒并继续感染家蚕细胞 | 第68-70页 |
| ·观察细胞发病情况 | 第68-69页 |
| ·第一次收集重组杆状病毒 | 第69页 |
| ·重组病毒基因组PCR 鉴定 | 第69-70页 |
| ·杆状病毒的扩大化 | 第70页 |
| ·融合基因在家蚕细胞中的表达鉴定 | 第70页 |
| 3. 结果分析 | 第70-74页 |
| ·融合基因Ph-HW 的回收 | 第70-71页 |
| ·融合基因Ph-HW 与pFastBac~(TM)HTb 质粒的融合鉴定 | 第71-72页 |
| ·重组质粒pFastBac~(TM)HTb 测序结果 | 第72页 |
| ·重组质粒pFast-Ph-HW 与E. coli DH10Bac~(TM)中bacmid 质粒同源重组及鉴定 | 第72-73页 |
| ·重组病毒基因组的PCR 鉴定 | 第73页 |
| ·融合目的蛋白在家蚕细胞中表达的鉴定 | 第73-74页 |
| 4. 讨论 | 第74-75页 |
| 第五章 HW 基因的RNAi 对家蚕培养细胞生物活性的影响 | 第75-81页 |
| 1. 材料与试剂 | 第75-76页 |
| ·材料 | 第75页 |
| ·试剂 | 第75页 |
| ·试剂的配制 | 第75-76页 |
| 2. 方法 | 第76-78页 |
| ·dsRNA 的合成 | 第76-77页 |
| ·合成体外转录模板 | 第76-77页 |
| ·体外转录RNA | 第77页 |
| ·dsRNA 浓度的测定 | 第77页 |
| ·RNAi----dsRNA 的转染 | 第77-78页 |
| ·MTT 检测细胞变化情况 | 第78页 |
| 3. 结果 | 第78-80页 |
| ·dsRNA 的合成 | 第78-79页 |
| ·HW RNAi 的MTT 检测结果分析 | 第79-80页 |
| 4. 讨论 | 第80-81页 |
| 第六章 家蚕体内新膜蛋白HW 的结晶初探 | 第81-86页 |
| 1. 材料和试剂 | 第81页 |
| 2. 方法 | 第81-83页 |
| ·纯化HW 蛋白浓度的测定 | 第81-82页 |
| ·膜蛋白HW 的脱盐、浓缩 | 第82页 |
| ·盖玻片的硅化 | 第82页 |
| ·结晶试剂盒点蛋白样品 | 第82-83页 |
| ·观察样品结晶情况 | 第83页 |
| 3. 结果 | 第83-84页 |
| ·纯化蛋白浓度测定 | 第83页 |
| ·纯化蛋白的脱盐浓缩 | 第83-84页 |
| ·蛋白的结晶分析 | 第84页 |
| 4. 讨论 | 第84-86页 |
| 结论与创新点 | 第86-87页 |
| 参考文献 | 第87-92页 |
| 致谢 | 第92页 |
