| 致谢 | 第1-15页 |
| 摘要 | 第15-19页 |
| ABSTRACT | 第19-24页 |
| 第一章 文献综述:马铃薯病毒诊断方法的研究进展 | 第24-36页 |
| ·马铃薯作物的特性及其经济价值 | 第24-34页 |
| ·马铃薯特性 | 第24页 |
| ·马铃薯经济价值 | 第24-25页 |
| ·重要病虫害 | 第25页 |
| ·马铃薯病毒病及其重要性 | 第25-27页 |
| ·马铃薯无毒种薯生产的重要性 | 第27-28页 |
| ·马铃薯病毒诊断方法 | 第28-34页 |
| ·症状学观察 | 第28-29页 |
| ·指示植物测定 | 第29页 |
| ·电子显微镜技术 | 第29页 |
| ·双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)分析 | 第29-30页 |
| ·血清学方法检测 | 第30页 |
| ·核酸斑点杂交(Nucleic acid spot hybridization,NASH) | 第30-31页 |
| ·聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR) | 第31-33页 |
| ·DNA微点阵(DNA microarray) | 第33-34页 |
| ·研究目的和意义 | 第34页 |
| ·研究内容 | 第34-35页 |
| ·研究的创新点 | 第35-36页 |
| 第二章 侵染马铃薯的主要病毒和类病毒基因克隆与序列分析 | 第36-44页 |
| ·材料和方法 | 第36-39页 |
| ·毒源保存 | 第36-37页 |
| ·总RNA的提取 | 第37页 |
| ·引物设计和合成 | 第37-38页 |
| ·反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) | 第38页 |
| ·PCR产物(目的片段)回收 | 第38页 |
| ·DNA片段的连接和转化 | 第38页 |
| ·碱法少量提取重组质粒 | 第38-39页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第39页 |
| ·序列测定及分析 | 第39页 |
| ·结果与分析 | 第39-43页 |
| ·PVA部分核苷酸序列的测定 | 第39-40页 |
| ·RT-PCR扩增结果 | 第39页 |
| ·测序鉴定和同源性分析结果 | 第39-40页 |
| ·PVX部分核苷酸序列的测定 | 第40页 |
| ·RT-PCR扩增结果 | 第40页 |
| ·测序鉴定和同源性分析结果 | 第40页 |
| ·PVY部分核苷酸序列的测定 | 第40-41页 |
| ·RT-PCR扩增结果 | 第40页 |
| ·测序鉴定和同源性分析结果 | 第40-41页 |
| ·PLRV部分核苷酸序列的测定 | 第41页 |
| ·RT-PCR扩增结果 | 第41页 |
| ·测序鉴定和同源性分析结果 | 第41页 |
| ·PVS部分核苷酸序列的测定 | 第41页 |
| ·RT-PCR扩增结果 | 第41页 |
| ·测序鉴定和同源性分析结果 | 第41页 |
| ·PSTVd部分核苷酸序列的测定 | 第41-42页 |
| ·RT-PCR扩增结果 | 第41-42页 |
| ·测序鉴定和同源性分析结果 | 第42页 |
| ·CMV部分核苷酸序列的测定 | 第42页 |
| ·RT-PCR扩增结果 | 第42页 |
| ·测序鉴定和同源性分析结果 | 第42页 |
| ·TMV部分核苷酸序列的测定 | 第42-43页 |
| ·RT-PCR扩增结果 | 第42页 |
| ·测序鉴定和同源性分析结果 | 第42-43页 |
| ·18S rRNA部分核苷酸序列的测定 | 第43页 |
| ·RT-PCR扩增结果 | 第43页 |
| ·测序鉴定和同源性分析结果 | 第43页 |
| ·小结 | 第43-44页 |
| 第三章 病毒粒子直接吸附—反转录—聚合酶链式反应检测马铃薯病毒 | 第44-56页 |
| ·材料和方法 | 第45-47页 |
| ·毒源 | 第45页 |
| ·马铃薯样品 | 第45页 |
| ·病毒RNA制备的优化 | 第45-46页 |
| ·病毒特异引物的设计和合成 | 第46页 |
| ·RT-PCR | 第46页 |
| ·克隆和测序 | 第46-47页 |
| ·病毒RNA保存期限的测定 | 第47页 |
| ·VDA-RT-PCR和免疫捕捉RT-PCR的灵敏度比较 | 第47页 |
| ·结果和分析 | 第47-53页 |
| ·病毒RNA制备的优化结果 | 第47-50页 |
| ·四种病毒提取缓冲液的比较结果 | 第47-48页 |
| ·不同孵育时间对病毒粒子在离心管表面结合的影响 | 第48-49页 |
| ·不同变性温度对病毒RNA释放的影响 | 第49-50页 |
| ·病毒RNA保存期限的测定结果 | 第50页 |
| ·灵敏度比较结果 | 第50-51页 |
| ·马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒3'末端核酸序列扩增的结果 | 第51-52页 |
| ·VDA-RT-PCR检测田间马铃薯样品的结果 | 第52-53页 |
| ·讨论 | 第53-56页 |
| 第四章 以18S RRNA作为内参照同时检测5种马铃薯病毒的多重RT-PCR体系的优化和应用 | 第56-70页 |
| ·材料和方法 | 第57-59页 |
| ·毒源 | 第57页 |
| ·马铃薯样品 | 第57页 |
| ·总RNA的提取 | 第57页 |
| ·引物设计和合成 | 第57-58页 |
| ·单个病毒反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) | 第58页 |
| ·nad2 mRNA部分序列的RT-PCR扩增 | 第58页 |
| ·nad2 mRNA部分序列的克隆和测序 | 第58页 |
| ·18S rRNA与nad2 mRNA的灵敏度和稳定性比较 | 第58页 |
| ·多重RT-PCR的优化 | 第58-59页 |
| ·双夹心-酶联免疫吸附试验(DAS-ELISA) | 第59页 |
| ·多重RT-PCR和DAS-ELISA的检测极限的比较 | 第59页 |
| ·结果 | 第59-67页 |
| ·nad2 mRNA部分核苷酸序列的扩增和克隆测序 | 第59-60页 |
| ·18S rRNA与nad2 mRNA的比较结果 | 第60-62页 |
| ·多重RT-PCR的优化 | 第62-65页 |
| ·优化的多重RT-PCR与DAS-ELISA的检测极限比较 | 第65-67页 |
| ·田间马铃薯样品的检测结果 | 第67页 |
| ·讨论 | 第67-70页 |
| 第五章 用于同时检测7种马铃薯病毒和1种类病毒的寡聚核苷酸微点阵的制备 | 第70-84页 |
| ·材料和方法 | 第73-76页 |
| ·病毒和类病毒 | 第73页 |
| ·马铃薯样品 | 第73页 |
| ·总RNA的提取 | 第73页 |
| ·引物和寡聚核苷酸探针的设计和合成 | 第73页 |
| ·RT-PCR | 第73页 |
| ·多重PCR的建立 | 第73-74页 |
| ·CY5荧光标记 | 第74页 |
| ·寡核苷酸微芯片的构建 | 第74-75页 |
| ·寡核苷酸微芯片的杂交 | 第75页 |
| ·扫描和数据分析 | 第75页 |
| ·RNA核酸斑点杂交 | 第75页 |
| ·寡聚核苷酸微点阵与核酸斑点杂交的检测灵敏度比较 | 第75-76页 |
| ·结果 | 第76-82页 |
| ·RT-PCR扩增结果 | 第76页 |
| ·不同杂交温度对杂交效率的影响和杂交的特异性 | 第76-77页 |
| ·多重标记PCR的建立 | 第77-79页 |
| ·寡聚核苷酸微点阵和RNA核酸斑点杂交的检测灵敏度比较 | 第79-80页 |
| ·不同CMV分离物的寡聚核苷酸微点阵检测结果 | 第80-81页 |
| ·田间样品的杂交检测结果 | 第81-82页 |
| ·讨论 | 第82-84页 |
| 第六章 一种高通量玻片杂交方法的建立与应用 | 第84-99页 |
| ·材料和方法 | 第85-88页 |
| ·病毒和类病毒 | 第85页 |
| ·TMV病毒粒子的提取 | 第85页 |
| ·病毒cDNA克隆和引物 | 第85页 |
| ·总RNA提取 | 第85页 |
| ·用~(32)P标记的探针进行尼龙膜杂交 | 第85-86页 |
| ·用荧光染料CY5标记的探针进行玻片杂交 | 第86-87页 |
| ·RNA样品的点样 | 第86页 |
| ·CY5标记探针的制备 | 第86-87页 |
| ·玻片杂交 | 第87页 |
| ·玻片扫描和数据分析 | 第87页 |
| ·不同点样缓冲液对RNA结合效率的影响 | 第87页 |
| ·不同修饰类型的玻片对RNA结合效率的影响 | 第87-88页 |
| ·玻片杂交和尼龙膜杂交的检测灵敏度比较 | 第88页 |
| ·结果 | 第88-96页 |
| ·不同点样液对RNA结合效率的影响 | 第88-89页 |
| ·不同修饰类型的玻片对RNA结合效率的影响 | 第89-90页 |
| ·玻片杂交和尼龙膜杂交检测灵敏度的比较 | 第90-92页 |
| ·玻片杂交的特异性检验 | 第92-94页 |
| ·田间马铃薯样品的检测结果 | 第94-96页 |
| ·讨论 | 第96-99页 |
| 总结 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-108页 |
| 附录1.重要溶液的配制 | 第108-110页 |
| 附录2.在读博士研究生期间发表和投稿中的研究论文 | 第110页 |
