| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 第一章 综述 | 第12-27页 |
| 引言 | 第12-13页 |
| 1 副溶血弧菌的发现、危害与污染状况 | 第13页 |
| 2 副溶血弧菌的生物学特性 | 第13-20页 |
| ·基因组DNA | 第14页 |
| ·质粒DNA | 第14-15页 |
| ·毒力因子 | 第15-19页 |
| ·溶血毒素 | 第15-17页 |
| ·尿素酶 | 第17页 |
| ·黏附素 | 第17-18页 |
| ·侵袭力 | 第18-19页 |
| ·鞭毛基因系统 | 第19-20页 |
| 3 副溶血弧菌的检测技术 | 第20-22页 |
| ·传统的检测方法 | 第20页 |
| ·PCR 检测方法 | 第20-21页 |
| ·酶联免疫吸附法 | 第21页 |
| ·电化学免疫传感器法 | 第21-22页 |
| ·探针检测法 | 第22页 |
| 4 基因工程单链抗体技术 | 第22-26页 |
| ·pCANTAB-5E 载体系统 | 第22-23页 |
| ·M13K07 | 第23-25页 |
| ·单链抗体的应用 | 第25-26页 |
| ·靶向作用的应用 | 第25页 |
| ·细胞内免疫作用的应用 | 第25页 |
| ·展望 | 第25-26页 |
| 5 本实验的目的与意义 | 第26-27页 |
| 第二章 副溶血弧菌极鞭毛蛋白的高效表达与鉴定 | 第27-44页 |
| 引言 | 第27页 |
| 材料与方法 | 第27-37页 |
| 1 材料 | 第27-28页 |
| ·菌株与质粒 | 第27页 |
| ·培养基 | 第27-28页 |
| ·主要试剂与仪器 | 第28页 |
| 2 方法 | 第28-37页 |
| ·副溶血弧菌极鞭毛蛋白基因的引物设计与合成 | 第28-29页 |
| ·副溶血弧菌基因组的提取 | 第29-30页 |
| ·目的基因 flaB 的 PCR 扩增与回收 | 第30页 |
| ·PET32a(+) 质粒的提取 | 第30-31页 |
| ·酶切与连接 | 第31-32页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第32-33页 |
| ·转化 | 第33页 |
| ·重组质粒的筛选与验证 | 第33页 |
| ·IPTG 诱导表达 | 第33-35页 |
| ·序列测定 | 第35页 |
| ·纯化目的蛋白 | 第35-37页 |
| 结果与分析 | 第37-42页 |
| 1. PCR 扩增目的基因 | 第37页 |
| 2. 表达载体 pET32a-flaB 的构建 | 第37-39页 |
| 3. 融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达 | 第39-40页 |
| 4. Ni-NTA 纯化 | 第40-41页 |
| 5. 测序结果 | 第41-42页 |
| 讨论 | 第42-43页 |
| 1. FlaB 基因的引物设计 | 第42页 |
| 2. 酶切 | 第42页 |
| 3. 转化 | 第42页 |
| 4. IPTG 诱导 | 第42-43页 |
| 结论 | 第43-44页 |
| 第三章 基因工程单链抗体的制备 | 第44-63页 |
| 引言 | 第44页 |
| 材料与方法 | 第44-54页 |
| 1 材料 | 第44-46页 |
| ·主要菌株与质粒 | 第44页 |
| ·抗体可变区的通用引物 | 第44-45页 |
| ·培养基 | 第45页 |
| ·主要试剂与仪器 | 第45-46页 |
| 2 实验方法 | 第46-54页 |
| ·小鼠的免疫方案 | 第46页 |
| ·血清效价的测定 | 第46-47页 |
| ·总RNA 的提取 | 第47-48页 |
| ·RT-PCR | 第48页 |
| ·重、轻链可变区基因的PCR 扩增 | 第48-49页 |
| ·scFv DNA 的组装与扩增 | 第49页 |
| ·scFv DNA 和载体 pCANTAB-5E 的 SfiⅠ/NotⅠ片段化 | 第49-50页 |
| ·pCANTAB-5E-scFv 重组质粒的构建 | 第50页 |
| ·重组噬菌体抗体库的建立 | 第50页 |
| ·库容量的滴定 | 第50-51页 |
| ·噬菌体抗体库的富集淘选 | 第51-52页 |
| ·ELISA 检测 | 第52页 |
| ·scFv 的酶切与 PCR 验证 | 第52页 |
| ·scFv 可溶性表达 | 第52-53页 |
| ·scFv 的序列测定 | 第53-54页 |
| 结果与分析 | 第54-60页 |
| 1. 血清效价的测定 | 第54-55页 |
| 2. VH、VL 的PCR 扩增 | 第55页 |
| 3. scFv DNA 的组装与扩增 | 第55-56页 |
| 4. 噬菌体抗体库的库容量 | 第56页 |
| 5. 噬菌体单链抗体库富集淘选后 ELISA 检测 | 第56-57页 |
| 6. 酶切和PCR 验证 | 第57-58页 |
| 7. scFv 的可溶性表达 | 第58-59页 |
| 8. 单链抗体的序列测定 | 第59-60页 |
| 讨论 | 第60-62页 |
| 1. 免疫用抗原 | 第60页 |
| 2. 免疫用佐剂 | 第60页 |
| 3. 总RNA 的提取 | 第60页 |
| 4. scFv 的组装与扩增 | 第60-61页 |
| 5. 抗体基因表达的控制子 | 第61-62页 |
| 结论 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-68页 |
| 附录：相关培养基及溶液的配制 | 第68-71页 |
| 致谢 | 第71页 |