| 摘要 | 第3-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第1章 前言 | 第12-27页 |
| 1.1 肝素 | 第12-13页 |
| 1.2 肝素酶的概况 | 第13-14页 |
| 1.3 肝素酶的研究进展 | 第14-19页 |
| 1.3.1 肝素酶的来源及分类 | 第14页 |
| 1.3.2 肝素酶的结构 | 第14-15页 |
| 1.3.3 肝素酶的性质 | 第15页 |
| 1.3.4 肝素酶的作用机理 | 第15-16页 |
| 1.3.5 肝素酶的传统发酵生产 | 第16页 |
| 1.3.6 重组肝素酶的表达研究 | 第16-17页 |
| 1.3.7 肝素酶的应用 | 第17-19页 |
| 1.3.8 肝素酶的临床医学用途 | 第19页 |
| 1.4 巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展 | 第19-24页 |
| 1.4.1 巴斯德毕赤酵母表达系统的优点 | 第20页 |
| 1.4.2 影响毕赤酵母表达外源蛋白的因素 | 第20-23页 |
| 1.4.3 巴斯德毕赤酵母的高密度培养 | 第23-24页 |
| 1.5 实验选题依据、研究内容以及技术路线 | 第24-27页 |
| 1.5.1 选题依据 | 第24页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第24-26页 |
| 1.5.3 技术路线 | 第26-27页 |
| 第2章 肝素酶真核表达载体pPIC9K-Hpa Ⅰ的构建 | 第27-45页 |
| 2.1 材料 | 第27-30页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第27页 |
| 2.1.2 培养基 | 第27页 |
| 2.1.3 电泳凝胶的制备 | 第27-28页 |
| 2.1.4 主要试剂 | 第28-29页 |
| 2.1.5 仪器设备 | 第29-30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-37页 |
| 2.2.1 肝素黄杆菌基因组DNA的提取 | 第30-31页 |
| 2.2.2 肝素酶Hpa Ⅰ基因的扩增 | 第31-33页 |
| 2.2.3 pPIC9K质粒的提取 | 第33页 |
| 2.2.4 重组质粒pPIC9K-Hpa Ⅰ基因的构建 | 第33-36页 |
| 2.2.5 重组转化质粒的鉴定 | 第36-37页 |
| 2.2.6 表达载体pPIC9K-Hpa Ⅰ测序 | 第37页 |
| 2.3 结果与分析 | 第37-43页 |
| 2.3.1 Hpa Ⅰ基因的获取 | 第37-38页 |
| 2.3.2 pPIC9K质粒的提取结果 | 第38页 |
| 2.3.3 重组质粒pPIC9K-Hpa Ⅰ的构建 | 第38-41页 |
| 2.3.4 转化子(pPIC9K-Hpa Ⅰ)的筛选与鉴定 | 第41-42页 |
| 2.3.5 重组质粒pPIC9K-Hpa Ⅰ测序结果及分析 | 第42-43页 |
| 2.4 结论 | 第43-45页 |
| 第3章 重组表达载体pPIC9K-Hpa Ⅰ转染毕赤酵母宿主菌GS115 | 第45-57页 |
| 3.1 材料 | 第45-48页 |
| 3.1.1 菌株 | 第45页 |
| 3.1.2 培养基 | 第45-46页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第46-47页 |
| 3.1.4 仪器设备 | 第47-48页 |
| 3.2 实验方法 | 第48-53页 |
| 3.2.1 重组表达载体pPIC9K-Hpa Ⅰ质粒的提取 | 第48页 |
| 3.2.2 重组表达载体pPIC9K-Hpa Ⅰ的线性化 | 第48页 |
| 3.2.3 重组质粒pPIC9K-Hpa Ⅰ转染毕赤酵母 | 第48-49页 |
| 3.2.4 重组酵母转化子的PCR鉴定 | 第49-50页 |
| 3.2.5 重组毕赤酵母的诱导表达及酶活测定 | 第50-52页 |
| 3.2.6 表达产物的SDS-PAGE分析 | 第52-53页 |
| 3.3 结果与分析 | 第53-56页 |
| 3.3.1 重组表达载体pPIC9K-Hpa Ⅰ质粒的线性化 | 第53-54页 |
| 3.3.2 酵母的电击转化及筛选 | 第54-55页 |
| 3.3.3 重组酵母子的PCR鉴定 | 第55页 |
| 3.3.4 表达产物的SDS-PAGE分析 | 第55-56页 |
| 3.4 结论 | 第56-57页 |
| 第4章 毕赤酵母产肝素酶摇瓶发酵条件优化的研究 | 第57-75页 |
| 4.1 材料 | 第57-58页 |
| 4.1.1 菌种 | 第57页 |
| 4.1.2 培养基 | 第57页 |
| 4.1.3 主要试剂 | 第57-58页 |
| 4.1.4 仪器设备 | 第58页 |
| 4.2 实验方法 | 第58-62页 |
| 4.2.1 菌种保藏 | 第58页 |
| 4.2.2 肝素酶活性的测定 | 第58页 |
| 4.2.3 蛋白质浓度的测定 | 第58-59页 |
| 4.2.4 摇瓶发酵产肝素酶条件的确定 | 第59-61页 |
| 4.2.5 响应面设计 | 第61-62页 |
| 4.3 结果与分析 | 第62-74页 |
| 4.3.1 甲醇诱导时间对毕赤酵母发酵的影响 | 第62-63页 |
| 4.3.2 甲醇浓度对毕赤酵母发酵的影响 | 第63-64页 |
| 4.3.3 装液量对毕赤酵母发酵的影响 | 第64-65页 |
| 4.3.4 油酸对肝素酶表达的影响 | 第65-66页 |
| 4.3.5 PTM1对肝素酶表达的影响 | 第66-67页 |
| 4.3.6 Tween-80对肝素酶表达的影响 | 第67-68页 |
| 4.3.7 诱导前不同菌体浓度对肝素酶表达的影响 | 第68页 |
| 4.3.8 2-level Factorial实验设计和结果 | 第68-70页 |
| 4.3.9 Box-Behnken实验设计和结果 | 第70-74页 |
| 4.3.10 蛋白质含量 | 第74页 |
| 4.4 结论 | 第74-75页 |
| 第5章 重组酵母高密度发酵研究 | 第75-81页 |
| 5.1 材料 | 第75-76页 |
| 5.1.1 菌种 | 第75页 |
| 5.1.2 培养基 | 第75页 |
| 5.1.3 主要试剂 | 第75页 |
| 5.1.4 仪器设备 | 第75-76页 |
| 5.2 实验方法 | 第76-78页 |
| 5.2.1 种子培养 | 第76页 |
| 5.2.2 补料高密度发酵培养及诱导方法 | 第76-77页 |
| 5.2.3 OD_(600)测定 | 第77页 |
| 5.2.4 菌体湿重测定 | 第77页 |
| 5.2.5 甘油含量测定 | 第77页 |
| 5.2.6 肝素酶活性测定 | 第77页 |
| 5.2.7 pH值测定 | 第77-78页 |
| 5.2.8 DO值测定 | 第78页 |
| 5.3 结果与分析 | 第78-80页 |
| 5.3.1 甘油补料的策略 | 第78页 |
| 5.3.2 甲醇流加的策略 | 第78-79页 |
| 5.3.3 诱导阶段肝素酶活性和蛋白质含量变化 | 第79页 |
| 5.3.4 高密度发酵液的SDS-PAGE分析 | 第79-80页 |
| 5.4 结论 | 第80-81页 |
| 第6章 结论 | 第81-84页 |
| 6.1 课题总结 | 第81-82页 |
| 6.2 创新点 | 第82页 |
| 6.3 进一步研究的内容与建议 | 第82-84页 |
| 参考文献 | 第84-90页 |
| 致谢 | 第90-91页 |
| 附录 | 第91-94页 |
