| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 主要符号表 | 第15-16页 |
| 第一部分 文献综述 | 第16-29页 |
| 1.1 CRISPR-Cas系统的简介、分类及应用 | 第16-18页 |
| 1.1.1 CRISPR-Cas系统的简介 | 第16页 |
| 1.1.2 CRISPR-Cas系统的分类 | 第16-17页 |
| 1.1.3 CRISPR-Cas系统的应用 | 第17-18页 |
| 1.2 基因编辑与基因编程酶的简介 | 第18-24页 |
| 1.2.1 基因编辑与基因编程酶的内涵 | 第18-21页 |
| 1.2.2 基因编程酶的发展历程与比较 | 第21-23页 |
| 1.2.3 基因编辑的应用与意义 | 第23-24页 |
| 1.3 基因装配与基因组工程的简介 | 第24-27页 |
| 1.3.1 基因装配与基因组工程的内涵 | 第24-25页 |
| 1.3.2 基因装配与基因组工程的发展历程 | 第25-26页 |
| 1.3.3 基因装配与基因组工程的应用与意义 | 第26-27页 |
| 1.4 本文的研究目的及意义 | 第27-29页 |
| 第二部分 材料与方法 | 第29-40页 |
| 2.1 材料 | 第29-32页 |
| 2.1.1 Strains | 第29页 |
| 2.1.2 Plasmids | 第29-30页 |
| 2.1.3 培养基 | 第30页 |
| 2.1.4 药品试剂 | 第30页 |
| 2.1.5 仪器和设备 | 第30页 |
| 2.1.6 实验所需试剂的配制方法 | 第30-31页 |
| 2.1.6.1 抽提质粒试剂 | 第30-31页 |
| 2.1.6.2 琼脂糖凝胶相关缓冲液 | 第31页 |
| 2.1.6.3 SDS-PAGE相关溶液 | 第31页 |
| 2.1.6.4 Western Blotting相关溶液 | 第31页 |
| 2.1.6.5 蛋白质纯化缓冲液 | 第31页 |
| 2.1.7 引物 | 第31-32页 |
| 2.2 实验方法 | 第32-40页 |
| 2.2.1 FnCpf1基因的获得 | 第32页 |
| 2.2.2 回收纯化目的DNA片段 | 第32-33页 |
| 2.2.3 DNA克隆 | 第33-34页 |
| 2.2.4 TB法制备大肠杆菌感受态 | 第34页 |
| 2.2.5 E.coli的常规转化、快速转化 | 第34页 |
| 2.2.6 重组质粒的鉴定、提取 | 第34页 |
| 2.2.6.1 重组质粒的鉴定 | 第34页 |
| 2.2.6.2 碱裂解提取质粒 | 第34页 |
| 2.2.6.3 试剂盒提取质粒 | 第34页 |
| 2.2.7 外源基因FnCpf1在大肠杆菌中的异源表达 | 第34-35页 |
| 2.2.8 重组FnCpf1酶的纯化 | 第35页 |
| 2.2.9 SDS-PAGE与Western Blotting检测 | 第35-36页 |
| 2.2.9.1 SDS-PAGE检测 | 第35-36页 |
| 2.2.9.2 Western blotting检测 | 第36页 |
| 2.2.10 Bradford法蛋白质浓度的测定 | 第36-37页 |
| 2.2.11 引导RNA (sgRNA)的体外转录 | 第37-38页 |
| 2.2.11.1 RNA体外转录的基本原理 | 第37-38页 |
| 2.2.11.2 RNA体外转录的操作步骤 | 第38页 |
| 2.2.12 sgRNA介导FnCpf 1的酶切反应 | 第38-40页 |
| 第三部分 结果与分析 | 第40-59页 |
| 3.1 FnCpf1基因的表达质粒的构建 | 第40-41页 |
| 3.2 FnCpf1酶的表达、纯化和检测 | 第41-43页 |
| 3.2.1 FnCpf1酶在大肠杆菌中的表达 | 第41页 |
| 3.2.2 FnCpf1酶的纯化 | 第41-43页 |
| 3.3 sgRNA的体外转录 | 第43-44页 |
| 3.4 两条固定sgRNA介导FnCpf1对靶质粒的双位点酶切 | 第44-45页 |
| 3.5 温度对sgRNA介导FnCpf1的酶切反应的影响 | 第45-46页 |
| 3.6 一条简并sgRNA介导FnCpf1对靶质粒的双位点酶切的探索 | 第46-47页 |
| 3.7 一条末端6nt不匹配sgRNA介导FnCpf1对靶质粒的双位点酶切的探索 | 第47-50页 |
| 3.8 一条末端6nt不匹配sgRNA介导FnCpf1对多种靶质粒的双位点酶切 | 第50-51页 |
| 3.9 一条sgRNA介导的FnCpf1酶对简并性酶切位点的切割 | 第51-52页 |
| 3.10 一条sgRNA介导的FnCpf1酶可充当限制性内切酶 | 第52-54页 |
| 3.11 一条sgRNA介导的FnCpf1酶指导多片段的装配 | 第54-56页 |
| 3.12 一条sgRNA介导的FnCpf1酶的切割与T5核酸外切酶连用进行多片段装配 | 第56-59页 |
| 第四部分 讨论与展望 | 第59-62页 |
| 4.1 讨论 | 第59-60页 |
| 4.2 展望 | 第60-62页 |
| 参考文献 | 第62-69页 |
| 附录 | 第69-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
