| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第一章 前言 | 第14-21页 |
| 1.1 α-淀粉酶概述 | 第14-15页 |
| 1.1.1 α-淀粉酶定义 | 第14页 |
| 1.1.2 α-淀粉酶的来源 | 第14页 |
| 1.1.3 α-淀粉酶的分类 | 第14页 |
| 1.1.4 α-淀粉酶的应用 | 第14-15页 |
| 1.1.5 耐酸性高温α-淀粉酶的研究现状 | 第15页 |
| 1.2 耐酸性高温α-淀粉酶的构建方法 | 第15-20页 |
| 1.2.1 构建耐酸性高温α-淀粉酶的方法 | 第15-16页 |
| 1.2.2 蛋白质的构象 | 第16页 |
| 1.2.3 确定蛋白质构象的技术 | 第16页 |
| 1.2.4 预测蛋白质构象的方法 | 第16-17页 |
| 1.2.5 蛋白质溶液构象的研究 | 第17-19页 |
| 1.2.5.1 圆二色光谱 | 第18页 |
| 1.2.5.2 荧光光谱 | 第18-19页 |
| 1.2.6 蛋白质的分子动力学模拟 | 第19-20页 |
| 1.3 研究背景和意义 | 第20-21页 |
| 第二章 耐酸性高温α-淀粉酶的构建、表达纯化和酶学性质分析 | 第21-47页 |
| 2.1 引言 | 第21页 |
| 2.2 实验材料与仪器 | 第21-27页 |
| 2.2.1 实验仪器 | 第21-23页 |
| 2.2.2 实验材料 | 第23-25页 |
| 2.2.3 实验试剂 | 第25-27页 |
| 2.3 实验方法 | 第27-37页 |
| 2.3.1 耐酸性高温淀粉酶生产菌鉴定 | 第27-29页 |
| 2.3.2 七种耐酸性高温α-淀粉酶质粒插入组氨酸标签 | 第29-30页 |
| 2.3.3 淀粉酶表达质粒的构建 | 第30-31页 |
| 2.3.4 短小芽孢杆菌感受态的制备 | 第31页 |
| 2.3.5 质粒电转导 | 第31-32页 |
| 2.3.6 目的蛋白的表达 | 第32页 |
| 2.3.6.1 菌种复筛 | 第32页 |
| 2.3.6.2 种子液的制备 | 第32页 |
| 2.3.6.3 发酵培养 | 第32页 |
| 2.3.6.4 粗酶液的制备 | 第32页 |
| 2.3.7 蛋白纯化 | 第32-34页 |
| 2.3.7.1 蛋白过滤 | 第32-33页 |
| 2.3.7.2 蛋白浓缩 | 第33-34页 |
| 2.3.7.3 镍柱亲和层析 | 第34页 |
| 2.3.7.4 分子筛纯化 | 第34页 |
| 2.3.8 测定蛋白浓度 | 第34-35页 |
| 2.3.9 SDS-PAGE鉴定目的蛋白 | 第35-36页 |
| 2.3.10 酶学性质分析 | 第36-37页 |
| 2.3.10.1 淀粉酶测定方法的建立 | 第36页 |
| 2.3.10.2 淀粉酶的最适温度 | 第36-37页 |
| 2.3.10.3 淀粉酶的最适pH | 第37页 |
| 2.3.10.4 淀粉酶的热稳定性 | 第37页 |
| 2.4 实验结果 | 第37-46页 |
| 2.4.1 基因组提取结果 | 第37-38页 |
| 2.4.2 质粒提取结果 | 第38-39页 |
| 2.4.3 全质粒PCR结果 | 第39页 |
| 2.4.4 双酶切结果 | 第39-40页 |
| 2.4.5 pNCMO_2-BLA质粒提取 | 第40页 |
| 2.4.6 蛋白表达纯化 | 第40-43页 |
| 2.4.7 酶学性质分析 | 第43-46页 |
| 2.5 本章小结 | 第46-47页 |
| 第三章 耐酸性高温α-淀粉酶突变体的构建、表达纯化和性质分析 | 第47-57页 |
| 3.1 引言 | 第47页 |
| 3.2 实验材料与仪器 | 第47-48页 |
| 3.2.1 实验材料 | 第47页 |
| 3.2.2 实验仪器 | 第47-48页 |
| 3.2.3 实验试剂 | 第48页 |
| 3.3 实验方法 | 第48-49页 |
| 3.3.1 淀粉酶突变体表达质粒的构建 | 第48页 |
| 3.3.2 淀粉酶突变体的表达 | 第48页 |
| 3.3.3 淀粉酶突变体的纯化 | 第48页 |
| 3.3.4 淀粉酶突变体的鉴定 | 第48页 |
| 3.3.5 酶学性质分析 | 第48-49页 |
| 3.3.5.1 最适温度测定 | 第48页 |
| 3.3.5.2 最适pH测定 | 第48页 |
| 3.3.5.3 热稳定性分析 | 第48-49页 |
| 3.3.5.4 动力学常数测定 | 第49页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第49-56页 |
| 3.4.1 突变体质粒提取 | 第49-50页 |
| 3.4.2 突变体的表达与纯化 | 第50-53页 |
| 3.4.3 酶学性质分析 | 第53-56页 |
| 3.4.3.1 最适温度 | 第53页 |
| 3.4.3.2 最适pH | 第53-54页 |
| 3.4.3.3 热稳定性测定结果 | 第54-55页 |
| 3.4.4.4 生化性质测定 | 第55-56页 |
| 3.5 本章小结 | 第56-57页 |
| 第四章 耐酸性高温α-淀粉酶突变体的热失活分析 | 第57-63页 |
| 4.1 引言 | 第57页 |
| 4.2 实验材料与仪器 | 第57-58页 |
| 4.2.1 实验材料 | 第57页 |
| 4.2.2 实验仪器 | 第57页 |
| 4.2.3 实验试剂 | 第57-58页 |
| 4.3 实验方法 | 第58-59页 |
| 4.3.1 以热失活曲线为基础的热失活动力学分析 | 第58页 |
| 4.3.2 圆二色谱实验 | 第58页 |
| 4.3.3 荧光光谱实验 | 第58-59页 |
| 4.4 结果与讨论 | 第59-61页 |
| 4.4.1 热失活动力学分析 | 第59页 |
| 4.4.2 圆二色光谱分析 | 第59-61页 |
| 4.4.3 荧光光谱分析 | 第61页 |
| 4.5 本章小结 | 第61-63页 |
| 第五章 耐酸性高温α-淀粉酶突变体的结构模拟和分子动力学模拟 | 第63-72页 |
| 5.1 引言 | 第63页 |
| 5.2 实验材料与仪器 | 第63页 |
| 5.3 实验方法 | 第63-64页 |
| 5.3.1 同源建模 | 第63-64页 |
| 5.3.2 氢键和盐桥的统计 | 第64页 |
| 5.3.3 分子动力学模拟 | 第64页 |
| 5.4 结果与讨论 | 第64-71页 |
| 5.4.1 同源建模 | 第64-65页 |
| 5.4.2 BLA-m9及其突变体的结构模拟比较分析 | 第65-68页 |
| 5.4.2.1 对15位点的分析 | 第66-67页 |
| 5.4.2.2 对188位点的分析 | 第67页 |
| 5.4.2.3 两点突变的分析 | 第67-68页 |
| 5.4.3 BLA-m9及其突变体的分子动力学模拟比较分析 | 第68-71页 |
| 5.5 本章小结 | 第71-72页 |
| 第六章 总结与展望 | 第72-74页 |
| 6.1 总结 | 第72-73页 |
| 6.2 展望 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-80页 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 | 第80-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
