| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 绪论 | 第9-18页 |
| 1.1 L-天冬氨酸概述 | 第9-10页 |
| 1.1.1 L-天冬氨酸的理化性质 | 第9页 |
| 1.1.2 L-天冬氨酸的应用 | 第9-10页 |
| 1.1.3 L-天冬氨酸的合成方法 | 第10页 |
| 1.2 L-天冬氨酸裂解酶的研究进展 | 第10-11页 |
| 1.3 马来酸顺反异构酶的研究进展 | 第11-13页 |
| 1.4 酶分子改造方法 | 第13-14页 |
| 1.5 多酶偶联生物催化概述 | 第14-15页 |
| 1.6 全细胞生物催化概述 | 第15页 |
| 1.7 细胞固定化概述 | 第15-16页 |
| 1.8 本课题立题意义及主要研究内容 | 第16-18页 |
| 1.8.1 本课题的立题意义 | 第16页 |
| 1.8.2 本课题的研究内容 | 第16-18页 |
| 第二章 材料与方法 | 第18-30页 |
| 2.1 主要材料 | 第18-19页 |
| 2.1.1 菌株与质粒 | 第18页 |
| 2.1.2 主要仪器与设备 | 第18页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第18-19页 |
| 2.1.4 培养基 | 第19页 |
| 2.2 MaiA和AspA双酶共表达 | 第19-22页 |
| 2.2.1 共表达策略 | 第19页 |
| 2.2.2 共表达重组质粒构建 | 第19-20页 |
| 2.2.3 共表达菌株诱导表达 | 第20-21页 |
| 2.2.4 共表达菌株筛选 | 第21页 |
| 2.2.5 共表达菌株全细胞催化 | 第21页 |
| 2.2.6 马来酸、富马酸和L-天冬氨酸检测 | 第21页 |
| 2.2.7 pMA2的MaiA的RBS改造 | 第21-22页 |
| 2.2.8 全细胞回收利用 | 第22页 |
| 2.3 MaiA分子改造 | 第22-27页 |
| 2.3.1 突变位点选择 | 第22页 |
| 2.3.2 引物设计 | 第22-24页 |
| 2.3.3 质粒提取 | 第24页 |
| 2.3.4 定点突变 | 第24页 |
| 2.3.5 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第24-25页 |
| 2.3.6 阳性克隆的鉴定 | 第25页 |
| 2.3.7 目的蛋白的诱导表达 | 第25页 |
| 2.3.8 目的蛋白的纯化与浓度测定 | 第25页 |
| 2.3.9 突变体酶活检测 | 第25-26页 |
| 2.3.10 突变体酶半衰期测定 | 第26页 |
| 2.3.11 突变体酶最适反应温度和pH测定 | 第26页 |
| 2.3.12 突变体酶Tm值测定 | 第26页 |
| 2.3.13 动力学参数测定 | 第26页 |
| 2.3.14 突变酶的结构分析 | 第26-27页 |
| 2.3.15 突变体MaiA替换pMA2-RBS4中野生型MaiA | 第27页 |
| 2.4 细胞固定化 | 第27-28页 |
| 2.4.1 细胞固定化方法 | 第27-28页 |
| 2.4.2 固定化细胞颗粒催化转化 | 第28页 |
| 2.4.3 固定化细胞颗粒热稳定性 | 第28页 |
| 2.4.4 固定化方法的筛选 | 第28页 |
| 2.5 重组大肠杆菌5L发酵罐分批-补料培养 | 第28-30页 |
| 2.5.1 种子活化 | 第28页 |
| 2.5.2 5L发酵罐分批-补料培养 | 第28页 |
| 2.5.3 指数流加补料策略 | 第28-30页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第30-50页 |
| 3.1 MaiA与AspA共表达菌株的构建及优化 | 第30-34页 |
| 3.1.1 共表达重组质粒的构建及酶切验证 | 第30-31页 |
| 3.1.2 不同共表达策略对双酶共表达的影响 | 第31-32页 |
| 3.1.3 全细胞催化转化 | 第32页 |
| 3.1.4 RBS改造对MaiA表达量的影响 | 第32-34页 |
| 3.2 MaiA分子改造 | 第34-43页 |
| 3.2.1 MaiA氨基酸保守性分析 | 第34-35页 |
| 3.2.2 MaiA分子表面Gly和Lys预测 | 第35-36页 |
| 3.2.3 突变体的筛选 | 第36-38页 |
| 3.2.4 突变体酶的纯化 | 第38页 |
| 3.2.5 突变酶最适反应温度、pH及热稳定性分析 | 第38-40页 |
| 3.2.6 突变体酶的Tm值 | 第40页 |
| 3.2.7 突变体酶动力学参数 | 第40-41页 |
| 3.2.8 突变体酶结构分析 | 第41-42页 |
| 3.2.9 突变体MaiA替换pMA2-RBS4菌株中野生型MaiA | 第42-43页 |
| 3.3 细胞固定化 | 第43-46页 |
| 3.3.1 全细胞回收利用 | 第43-44页 |
| 3.3.2 固定化方法对酶活的影响 | 第44页 |
| 3.3.3 固定化方法催化稳定性比较 | 第44-45页 |
| 3.3.4 细胞固定化方法筛选及应用 | 第45-46页 |
| 3.4 重组大肠杆菌5L发酵罐发酵优化 | 第46-50页 |
| 3.4.1 指数流加补料策略 | 第46-47页 |
| 3.4.2 诱导时机对菌体的影响 | 第47-48页 |
| 3.4.3 IPTG浓度对菌体影响 | 第48-49页 |
| 3.4.4 高密度发酵菌株全细胞催化生产L-天冬氨酸 | 第49-50页 |
| 主要结论与展望 | 第50-51页 |
| 主要结论 | 第50页 |
| 展望 | 第50-51页 |
| 致谢 | 第51-52页 |
| 参考文献 | 第52-57页 |
| 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第57页 |
