| 摘要 | 第7-9页 |
| ABSTRACT | 第9-10页 |
| 缩略语表 | 第11-12页 |
| 第一章 苏云金芽胞杆菌胶原酶在Bt感染昆虫中的功能研究 | 第12-58页 |
| 1 前言 | 第12-24页 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌及其杀虫活性 | 第12-14页 |
| 1.1.1 苏云金芽胞杆菌简介 | 第12页 |
| 1.1.2 苏云金芽胞杆菌的生物活性成分 | 第12-14页 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的作用模式 | 第14-16页 |
| 1.3 蜡状芽胞杆菌群的毒力因子 | 第16-19页 |
| 1.4 胶原和胶原酶 | 第19-23页 |
| 1.4.1 胶原的结构与类型 | 第19页 |
| 1.4.2 胶原酶概述 | 第19-22页 |
| 1.4.3 细菌胶原酶的应用 | 第22-23页 |
| 1.5 研究目的和意义 | 第23-24页 |
| 2 材料与方法 | 第24-39页 |
| 2.1 实验材料 | 第24-29页 |
| 2.1.1 菌株、质粒和引物 | 第24-26页 |
| 2.1.2 培养基 | 第26-27页 |
| 2.1.3 试剂 | 第27-29页 |
| 2.1.3.1 质粒抽提所用试剂 | 第27页 |
| 2.1.3.2 感受态制备所用试剂 | 第27页 |
| 2.1.3.3 SDS-PAGE凝胶电泳所用试剂 | 第27页 |
| 2.1.3.4 供试昆虫及生物测定饲料 | 第27-28页 |
| 2.1.3.5 胶原酶活性测定所用试剂 | 第28页 |
| 2.1.3.6 酶和其它试剂 | 第28-29页 |
| 2.1.4 仪器 | 第29页 |
| 2.2 实验方法 | 第29-39页 |
| 2.2.1 常规DNA操作 | 第29-32页 |
| 2.2.1.1 苏云金芽胞杆菌质粒的抽提 | 第29页 |
| 2.2.1.2 大肠杆菌质粒的抽提 | 第29页 |
| 2.2.1.3 苏云金芽胞杆菌总DNA的抽提 | 第29-30页 |
| 2.2.1.4 质粒DNA的脱盐 | 第30页 |
| 2.2.1.5 DNA的体外重组 | 第30页 |
| 2.2.1.6 大肠杆菌的CaCl_2转化 | 第30页 |
| 2.2.1.7 苏云金芽胞杆菌的电转化 | 第30-31页 |
| 2.2.1.8 大肠杆菌转化子的筛选 | 第31页 |
| 2.2.1.9 苏云金芽胞杆菌重组菌的筛选 | 第31页 |
| 2.2.1.10 PCR扩增 | 第31-32页 |
| 2.2.1.11 凝胶试剂盒回收DNA片段 | 第32页 |
| 2.2.1.12 同源重组 | 第32页 |
| 2.2.2 RNA抽提及反转录PCR | 第32-34页 |
| 2.2.2.1 TRIzol法抽提RNA | 第32-33页 |
| 2.2.2.2 RT-PCR(Reverse transcript PCR) | 第33-34页 |
| 2.2.3 苏云金芽胞杆菌colB1基因的超量表达与纯化 | 第34页 |
| 2.2.4 杀虫晶体蛋白Cry1Ac的提纯 | 第34页 |
| 2.2.5 苏云金芽胞杆菌伴胞晶体显微镜观察 | 第34-35页 |
| 2.2.6 蛋白的SDS-PAGE电泳 | 第35页 |
| 2.2.6.1 配制SDS-PAGE凝胶 | 第35页 |
| 2.2.6.2 电泳、染色及脱色 | 第35页 |
| 2.2.6.3 SDS-PAGE电泳的蛋白样品制备 | 第35页 |
| 2.2.7 蛋白的定量 | 第35-36页 |
| 2.2.8 胶原酶的活性鉴定 | 第36-37页 |
| 2.2.8.1 明胶水解活性鉴定 | 第36页 |
| 2.2.8.2 胶原酶酶活测定 | 第36-37页 |
| 2.2.9 生物测定 | 第37-39页 |
| 2.2.9.1 棉铃虫混合饲料法 | 第37-38页 |
| 2.2.9.2 棉铃虫表面涂布法 | 第38-39页 |
| 3 结果与分析 | 第39-55页 |
| 3.1 苏云金芽胞杆菌胶原酶的序列分析 | 第39-42页 |
| 3.2 colB1基因在大肠杆菌中的表达和纯化 | 第42-43页 |
| 3.3 ColB1蛋白的活性鉴定 | 第43-44页 |
| 3.4 ColB1蛋白与Cry1Ac复配对棉铃虫的生物测定 | 第44-47页 |
| 3.4.1 杀虫晶体蛋白Cry1Ac的提纯和浓度测定 | 第44-45页 |
| 3.4.2 混合饲料法对棉铃虫的生物测定 | 第45-46页 |
| 3.4.3 表面涂布法对棉铃虫的生物测定 | 第46-47页 |
| 3.5 BMB171中ColB1在Bt感染昆虫中的功能研究 | 第47-55页 |
| 3.5.1 BMB171中colBl基因转录水平和表达水平检测 | 第47-49页 |
| 3.5.1.1 RT-PCR进行转录水平检测 | 第47-48页 |
| 3.5.1.2 荧光镜检进行表达水平检测 | 第48-49页 |
| 3.5.2 colB1插入缺失突变体的构建 | 第49-52页 |
| 3.5.2.1 插入缺失载体的构建 | 第49-51页 |
| 3.5.2.2 插入缺失突变体的筛选和验证 | 第51-52页 |
| 3.5.3 缺失突变体芽胞和Cry1Ac定量混合对棉铃虫的生物测定 | 第52-53页 |
| 3.5.4 缺失突变体发酵液对棉铃虫的生物测定 | 第53-55页 |
| 4 总结与讨论 | 第55-58页 |
| 第二章 苏云金芽胞杆菌表达载体的构建 | 第58-74页 |
| 1 前言 | 第58-64页 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的分类及其多样性 | 第58-59页 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的表达调控 | 第59-62页 |
| 1.2.1 转录水平的调控 | 第59-60页 |
| 1.2.2 转录后水平的调控 | 第60-61页 |
| 1.2.3 翻译水平的调控 | 第61页 |
| 1.2.4 翻译后水平的调控 | 第61-62页 |
| 1.3 S-层蛋白的启动子 | 第62-63页 |
| 1.4 研究目的和意义 | 第63-64页 |
| 2 材料与方法 | 第64-67页 |
| 2.1 实验材料 | 第64-66页 |
| 2.2 实验方法 | 第66-67页 |
| 3 结果与分析 | 第67-73页 |
| 3.1 利用cry1Ac基因表达调控元件构建苏云金芽胞杆菌表达载体 | 第67-71页 |
| 3.1.1 载体pBMB1A的构建 | 第67-68页 |
| 3.1.2 重组菌株的构建 | 第68-69页 |
| 3.1.3 重组菌株晶体形成和蛋白表达检测 | 第69-70页 |
| 3.1.4 重组菌株的生物测定 | 第70-71页 |
| 3.2 利用ctc2基因启动子构建苏云金芽胞杆菌表达载体 | 第71-73页 |
| 3.2.1 载体pBMBC2的构建 | 第71页 |
| 3.2.2 重组菌株的构建 | 第71-72页 |
| 3.2.3 重组菌株晶体形成和蛋白表达检测 | 第72-73页 |
| 4 总结与讨论 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-83页 |
| 致谢 | 第83页 |
