| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 缩略词 | 第9-14页 |
| 第一章 前言 | 第14-23页 |
| 1 PED的概述 | 第14页 |
| 2 PEDV的基因组结构和蛋白 | 第14-17页 |
| 2.1 PEDV非结构蛋白及功能 | 第15-16页 |
| 2.2 PEDV主要结构蛋白及功能 | 第16-17页 |
| 3 国内外PEDV基因工程疫苗研究进展 | 第17-20页 |
| 3.1 PEDV转基因植物疫苗 | 第17-18页 |
| 3.2 PEDV活载体疫苗 | 第18-19页 |
| 3.3 PEDV基因工程亚单位疫苗 | 第19-20页 |
| 4 杆状病毒及其在基因工程疫苗研究中的应用 | 第20-23页 |
| 4.1 杆状病毒的结构及病毒感染 | 第20-21页 |
| 4.2 杆状病毒在基因工程疫苗研究中的应用 | 第21-23页 |
| 第二章 研究方案设计 | 第23-25页 |
| 1 研究目的与意义 | 第23页 |
| 2 研究内容 | 第23-24页 |
| 3 技术路线 | 第24-25页 |
| 第三章 PEDV S1蛋白的原核表达、纯化及其兔多抗制备 | 第25-43页 |
| 1 引言 | 第25页 |
| 2 材料与方法 | 第25-37页 |
| 2.1 实验材料、试剂与仪器 | 第25-28页 |
| 2.2 引物设计及合成 | 第28-29页 |
| 2.3 重组表达质粒pET28a-S1(231-734)的构建 | 第29-32页 |
| 2.4 His-S1(231-734)融合蛋白的诱导表达及鉴定 | 第32-34页 |
| 2.5 His-S1(231-734)融合蛋白大量表达及割胶纯化 | 第34-35页 |
| 2.6 S1多克隆抗体制备 | 第35-37页 |
| 3 结果分析 | 第37-41页 |
| 3.1 S1(231-734) 基因的PCR扩增鉴定 | 第37-38页 |
| 3.2 pET28a-S1(231-734)/TG1重组菌的鉴定 | 第38页 |
| 3.3 重组质粒pET28a-S1(231-734)的序列测定 | 第38页 |
| 3.4 pET28a-S1(231-734)/BL21(DE3)的诱导表达及Western blotting鉴定 | 第38-39页 |
| 3.5 S1蛋白纯化鉴定 | 第39-40页 |
| 3.6 S1抗血清纯化 | 第40页 |
| 3.7 S1抗血清效价测定和特异性分析 | 第40-41页 |
| 4 讨论 | 第41-43页 |
| 第四章 PEDV S1重组杆状病毒构建及S1蛋白在Sf9细胞中的表达鉴定 | 第43-60页 |
| 1 引言 | 第43页 |
| 2 材料与方法 | 第43-51页 |
| 2.1 实验材料、试剂与仪器 | 第43-44页 |
| 2.2 引物设计及合成 | 第44页 |
| 2.3 S1基因的pFast BacHTB系列重组质粒构建 | 第44-47页 |
| 2.4 Bac-to-Bac系统构建重组Bacmid | 第47-48页 |
| 2.5 Sf9细胞的低温冻存、复苏及贴壁培养 | 第48-49页 |
| 2.6 P0代重组杆状病毒的制备 | 第49页 |
| 2.7 重组杆状病毒鉴定及滴度测定 | 第49-50页 |
| 2.8 PEDV S1融合蛋白胞内表达的Western blotting分析 | 第50页 |
| 2.9 重组杆状病毒增殖曲线及S1融合蛋白表达量分析 | 第50-51页 |
| 3 结果与分析 | 第51-58页 |
| 3.1 S1、SP-S1、TMD、SP-S1-TMD、eGFP基因片段扩增鉴定 | 第51页 |
| 3.2 重组菌的菌液PCR鉴定及重组质粒双酶切鉴定 | 第51-52页 |
| 3.3 重组质粒序列测定 | 第52-53页 |
| 3.4 重组Bacmid鉴定 | 第53-55页 |
| 3.5 细胞病变及荧光观察 | 第55-56页 |
| 3.6 重组杆状病毒的PCR鉴定 | 第56页 |
| 3.7 PEDV S1蛋白表达鉴定 | 第56-57页 |
| 3.8 病毒增殖曲线及S1融合蛋白表达量分析 | 第57-58页 |
| 4 讨论 | 第58-60页 |
| 第五章 S1蛋白在Sf9细胞中及在重组杆状病毒上的定位 | 第60-68页 |
| 1 引言 | 第60页 |
| 2 材料与方法 | 第60-64页 |
| 2.1 实验材料、试剂与仪器 | 第60-61页 |
| 2.2 S1融合蛋白亚细胞定位 | 第61-62页 |
| 2.3 展示S1融合蛋白的重组杆状病毒颗粒的验证 | 第62-64页 |
| 3 结果分析 | 第64-67页 |
| 3.1 细胞荧光观察 | 第64页 |
| 3.2 间接免疫荧光分析 | 第64-65页 |
| 3.3 PEDV S1融合蛋白在杆状病毒上的表达鉴定 | 第65-66页 |
| 3.4 电镜观察 | 第66-67页 |
| 3.5 免疫电镜检测 | 第67页 |
| 4 讨论 | 第67-68页 |
| 第六章 S1融合蛋白及表面展示S1蛋白的杆状病毒的免疫原性分析 | 第68-75页 |
| 1 引言 | 第68页 |
| 2 材料与方法 | 第68-71页 |
| 2.1 实验材料、试剂与仪器 | 第68-69页 |
| 2.2 免疫原 | 第69页 |
| 2.3 免疫小鼠 | 第69-70页 |
| 2.4 免疫鼠血清的效价检测 | 第70页 |
| 2.5 血清中和试验 | 第70页 |
| 2.6 脾淋巴细胞增殖 | 第70-71页 |
| 3 结果与分析 | 第71-73页 |
| 3.1 特异性抗体检测 | 第71-72页 |
| 3.2 血清中和试验 | 第72页 |
| 3.3 脾淋巴细胞增殖 | 第72-73页 |
| 4 讨论 | 第73-75页 |
| 结论 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-83页 |
| 致谢 | 第83页 |
