| 摘要 | 第3-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 第一章 绪论 | 第9-16页 |
| 1.1 氨肽酶的概述 | 第9-12页 |
| 1.1.1 氨肽酶的来源 | 第9页 |
| 1.1.2 氨肽酶的分类 | 第9-10页 |
| 1.1.3 氨肽酶的生物特性 | 第10-11页 |
| 1.1.4 氨肽酶的应用 | 第11-12页 |
| 1.2 脯氨酸氨肽酶的研究进展 | 第12-13页 |
| 1.2.1 国外研究进展 | 第12-13页 |
| 1.2.2 国内研究进展 | 第13页 |
| 1.3 B. subtilis表达系统 | 第13-15页 |
| 1.3.1 B. subtilis简介 | 第13页 |
| 1.3.2 B. subtilis表达系统的优势 | 第13-14页 |
| 1.3.3 B. subtilis表达系统的不足与发展 | 第14-15页 |
| 1.4 立题意义 | 第15页 |
| 1.5 本文研究内容 | 第15-16页 |
| 第二章 材料与方法 | 第16-25页 |
| 2.1 材料 | 第16-17页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第16页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第16页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第16-17页 |
| 2.1.4 培养基 | 第17页 |
| 2.2 实验方法 | 第17-23页 |
| 2.2.1 细菌质粒提取 | 第17-18页 |
| 2.2.2 脯氨酸氨肽酶基因的扩增 | 第18页 |
| 2.2.3 DNA片段的检测与回收 | 第18页 |
| 2.2.4 PCR产物与质粒双酶切 | 第18页 |
| 2.2.5 质粒与目的基因的连接 | 第18-19页 |
| 2.2.6 大肠杆菌感受态的制备 | 第19页 |
| 2.2.7 连接产物转化E. coli JM109感受态细胞 | 第19页 |
| 2.2.8 菌落PCR验证 | 第19-20页 |
| 2.2.9 重组质粒双酶切验证、PCR验证 | 第20页 |
| 2.2.10 B. subtilis WB600感受态制备及重组质粒的电转化 | 第20-21页 |
| 2.2.11 重组B. subtilis的快速验证以及双酶切验证 | 第21页 |
| 2.2.12 重组菌的发酵表达 | 第21页 |
| 2.2.13 重组菌胞外分泌策略 | 第21页 |
| 2.2.14 重组菌生长曲线的测定 | 第21页 |
| 2.2.15 重组菌摇瓶水平发酵条件优化 | 第21-22页 |
| 2.2.16 重组菌 7 L发酵罐上的发酵 | 第22页 |
| 2.2.17 重组脯氨酸氨肽酶的分离纯化 | 第22页 |
| 2.2.18 重组脯氨酸氨肽酶酶学性质研究 | 第22-23页 |
| 2.2.19 重组脯氨酸氨肽酶对酪蛋白的应用初探 | 第23页 |
| 2.3 分析方法 | 第23-25页 |
| 2.3.1 酶活测定 | 第23页 |
| 2.3.2 脯氨酸含量测定 | 第23-24页 |
| 2.3.3 菌体光密度的测定 | 第24页 |
| 2.3.4 蛋白质浓度的测定 | 第24页 |
| 2.3.5 SDS-PAGE分析 | 第24-25页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第25-46页 |
| 3.1 重组脯氨酸氨肽酶B. subtilis的构建与表达 | 第25-28页 |
| 3.1.1 重组质粒的构建 | 第25-27页 |
| 3.1.2 重组质粒转化B. subtilis WB600 | 第27页 |
| 3.1.3 重组B. subtilis发酵表达验证 | 第27-28页 |
| 3.2 重组脯氨酸氨肽酶胞外分泌策略 | 第28-29页 |
| 3.3 重组B. subtilis发酵条件优化 | 第29-34页 |
| 3.3.1 重组菌的生长曲线 | 第29-30页 |
| 3.3.2 单因素试验 | 第30-32页 |
| 3.3.3 正交实验 | 第32-34页 |
| 3.3.4 培养条件的验证实验 | 第34页 |
| 3.4 重组菌在 7 L发酵罐上的表达 | 第34-35页 |
| 3.5 胞外脯氨酸氨肽酶的分离纯化 | 第35-37页 |
| 3.5.1 硫酸铵盐析 | 第35页 |
| 3.5.2 Hitrap Q HP离子交换层析 | 第35-36页 |
| 3.5.3 SuperdexTM 7510/300 GL凝胶层析 | 第36页 |
| 3.5.4 脯氨酸氨肽酶的纯化结果分析 | 第36-37页 |
| 3.6 重组脯氨酸氨肽酶的酶学性质 | 第37-43页 |
| 3.6.1 最适pH及其pH稳定性 | 第37-38页 |
| 3.6.2 最适温度及其温度稳定性 | 第38-39页 |
| 3.6.3 金属离子对重组脯氨酸氨肽酶的影响 | 第39-40页 |
| 3.6.4 蛋白酶抑制剂对重组脯氨酸氨肽酶的影响 | 第40-41页 |
| 3.6.5 盐离子对重组脯氨酸氨肽酶的影响 | 第41页 |
| 3.6.6 重组脯氨酸氨肽酶的底物特异性 | 第41-43页 |
| 3.6.7 重组脯氨酸氨肽酶的动力学分析 | 第43页 |
| 3.7 重组脯氨酸氨肽酶与蛋白酶复配水解酪蛋白的应用初探 | 第43-46页 |
| 主要结论与展望 | 第46-48页 |
| 主要结论 | 第46-47页 |
| 展望 | 第47-48页 |
| 致谢 | 第48-49页 |
| 参考文献 | 第49-54页 |
| 附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第54-55页 |
| 附件 | 第55-57页 |
