| 中文摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-16页 |
| 第一章:前言 | 第16-48页 |
| 一.哺乳动物雄性生殖细胞的发育 | 第16-37页 |
| 1. 原始生殖细胞的起源及迁移 | 第16-21页 |
| 2. 精子发生 | 第21-25页 |
| 3. 生殖细胞发育过程中的表观遗传学 | 第25-37页 |
| 二.小鼠PIWI蛋白亚家族与piRNA(Piwi-interacting RNA) | 第37-40页 |
| 1. 小鼠Piwi亚家族与雄性生殖细胞的发育 | 第37-40页 |
| 2. 与Piwi相互作用的小分子RNA——piRNA(Piwi-interacting RNA) | 第40页 |
| 三.DNA甲基化与睾丸特异表达基因的转录调控 | 第40-46页 |
| 1. DNA甲基化及其机制 | 第41页 |
| 2. DNA甲基化的检测方法 | 第41-43页 |
| 3. DNA甲基化参与睾丸特异表达基因的转录调控 | 第43-46页 |
| 四.本研究的目的与意义 | 第46-48页 |
| 第二章:小鼠Miwi基因的表达与其启动子区甲基化模式 | 第48-73页 |
| 一.引言 | 第48-49页 |
| 二.材料 | 第49-52页 |
| 1. 实验动物 | 第49-50页 |
| 2. 菌株 | 第50页 |
| 3. 主要试剂及试剂盒 | 第50页 |
| 4. 试剂配方 | 第50-51页 |
| 5. 常用仪器 | 第51-52页 |
| 6. 引物 | 第52页 |
| 三.方法 | 第52-63页 |
| 1. 总RNA的提取及逆转录 | 第52-53页 |
| 2. RT-PCR,荧光定量PCR分析不同时期小鼠睾丸中Miwi的表达 | 第53-55页 |
| 3. 免疫荧光、免疫组化检测MIWI蛋白在成体小鼠睾丸中的表达 | 第55-56页 |
| 4. 启动子CpG岛分析 | 第56页 |
| 5. 流式细胞技术分离不同时期小鼠睾丸生殖细胞 | 第56-57页 |
| 6. 小鼠附睾精子的分离 | 第57-58页 |
| 7. 基因组的提取 | 第58页 |
| 8. 基因组的亚硫酸氰盐处理和甲基化扩增 | 第58-60页 |
| 9. 甲基化扩增PCR产物的克隆、测序及分析 | 第60-62页 |
| 10. Miwi基因启动子体外甲基化处理 | 第62-63页 |
| 11. 细胞转染 | 第63页 |
| 四.结果 | 第63-69页 |
| 1. 不同时期小鼠睾丸模板中Miwi基因mRNA的定量(不同时期小鼠睾丸Miwi基因mRNA 的定量分析) | 第63-64页 |
| 2. 成年小鼠睾丸中Miwi蛋白的表达 | 第64-65页 |
| 3. 启动子CpG岛分析 | 第65-66页 |
| 4. 精原细胞、粗线期精母细胞、圆形精子、支持细胞的分离 | 第66-67页 |
| 5. 不同组织及不同时期小鼠睾丸生殖细胞内Miwi启动子CpG岛的甲基化模式 | 第67-68页 |
| 6. Miwi启动子体外甲基化降低荧光素酶报告基因的表达 | 第68-69页 |
| 五.讨论 | 第69-73页 |
| 1. Miwi基因在不同时期小鼠睾丸中的表达模式 | 第69-70页 |
| 2. Miwi基因启动子区甲基化与其表达的关系 | 第70页 |
| 3. DNMT3b可能参与了Miwi启动子在圆形精子期后的从头起始甲基化 | 第70-73页 |
| 第三章:小鼠Miwi启动子的转录调控机制分析 | 第73-111页 |
| 一.引言 | 第73页 |
| 二.材料 | 第73-79页 |
| 1. 引物 | 第73-76页 |
| 2. 载体 | 第76页 |
| 3. 菌株和细胞 | 第76页 |
| 4. 试剂及试剂配方 | 第76-79页 |
| 5. 仪器 | 第79页 |
| 三.方法 | 第79-90页 |
| 1. 转录起始位点的鉴定 | 第79-81页 |
| 2. 构建表达载体和突变载体 | 第81-84页 |
| 3. 细胞培养与瞬时转染 | 第84-85页 |
| 4. 荧光素酶活性测定 | 第85页 |
| 5. 细胞核抽提物的提取 | 第85-86页 |
| 6. EMSA电泳迁移率检测 | 第86-88页 |
| 7. 染色质免疫共沉淀分析 | 第88-90页 |
| 四.结果 | 第90-106页 |
| 1. Miwi基因转录起始位点的鉴定 | 第90-91页 |
| 2. Miwi启动子的克隆及截短启动子活性的鉴定 | 第91-94页 |
| 3. Miwi启动子转录因子结合位点的生物信息学预测 | 第94页 |
| 4. Miwi启动子关键位点的突变分析 | 第94-95页 |
| 5. 转录因子真核表达载体的构建和验证 | 第95-96页 |
| 6. Miwi启动子与转录因子真核表达载体共转染 | 第96-98页 |
| 7. Miwi启动子与转录因子显性负效应质粒共转染 | 第98-99页 |
| 8. EMSA电泳迁移率检测 | 第99-103页 |
| 9. 染色质免疫共沉淀分析 | 第103-104页 |
| 10. E2 box中CpG二核苷酸甲基化阻止其与USF转录因子的结合 | 第104-106页 |
| 五.讨论 | 第106-111页 |
| 1. Miwi基因核心启动子位于Miwi基因第二个CpG岛上 | 第106-107页 |
| 2. E2 box中CpG位点的甲基化参与调控Miwi基因组织特异性表达 | 第107-108页 |
| 3. 转录因子NFY与USF参与Miwi基因的转录调控 | 第108-111页 |
| 第四章:Miwi启动子的转基因小鼠分析 | 第111-126页 |
| 一.引言 | 第111页 |
| 二.材料 | 第111-113页 |
| 1. 引物 | 第111-112页 |
| 2. 载体 | 第112页 |
| 3. 菌株和细胞 | 第112页 |
| 4. 试剂及配方 | 第112-113页 |
| 5. 仪器 | 第113页 |
| 三.方法 | 第113-118页 |
| 1. 构建转基因表达载体 | 第113-114页 |
| 2. 细胞培养与瞬时转染 | 第114页 |
| 3. 转基因小鼠的制备 | 第114-117页 |
| 4. 转基因小鼠睾丸切片的免疫组化 | 第117页 |
| 5. 流式检测及分离Miwi-GFP转基因小鼠睾丸中的荧光细胞 | 第117-118页 |
| 四.结果 | 第118-124页 |
| 1. 转基因表达载体Miwi-GFP细胞水平的验证 | 第118-119页 |
| 2. Miwi-GFP转基因小鼠的鉴定 | 第119页 |
| 3. Miwi-GFP转基因小鼠睾丸切片的荧光照及不同组织的Western blot检测 | 第119-120页 |
| 4. Miwi-GFP转基因睾丸切片的免疫组化 | 第120-121页 |
| 5. Miwi-GFP转基因小鼠睾丸细胞流式检测 | 第121-122页 |
| 6. Miwi-GFP转基因小鼠中Miwi-GFP转基因启动子甲基化模式 | 第122-124页 |
| 五.讨论 | 第124-126页 |
| 1. 303bp的Miwi启动子片段可指导外源基因在精子发生中特异表达 | 第124-126页 |
| 研究总结 | 第126-128页 |
| 参考文献 | 第128-142页 |
| 研究生期间发表论文 | 第142-143页 |
| 致谢 | 第143页 |
