| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-12页 |
| 第一部分 文献综述 | 第12-33页 |
| ·归位内切酶I-SceI的研究概况 | 第12-17页 |
| ·限制性内切酶的概念和命名 | 第12页 |
| ·限制性内切酶的发现 | 第12-13页 |
| ·限制与修饰现象与其系统的种类 | 第13-15页 |
| ·限制内切酶产生的末端 | 第15-16页 |
| ·归位内切酶I-SceI的概述 | 第16-17页 |
| ·Sso7d蛋白的研究概况 | 第17-26页 |
| ·古菌的界及多样性 | 第18-19页 |
| ·古菌的应用价值 | 第19-20页 |
| ·嗜热古细菌及其研究的意义 | 第20-22页 |
| ·硫磺矿硫化叶菌的概述 | 第22-24页 |
| ·Sso7d蛋白及应用进展 | 第24-26页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统 | 第26-33页 |
| ·巴斯德毕赤酵母系统的概述 | 第26-28页 |
| ·外源基因导入的方法 | 第28-29页 |
| ·整合方式 | 第28-29页 |
| ·转化方法 | 第29页 |
| ·影响外源蛋白在毕赤酵母中高效表达的因素 | 第29-31页 |
| ·目的基因的特性 | 第29-30页 |
| ·信号肽 | 第30页 |
| ·宿主的生长状态、整合方式和转化子表型 | 第30页 |
| ·培养条件 | 第30-31页 |
| ·外源蛋白的糖基化作用 | 第31-32页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统应用前景 | 第32-33页 |
| 第二部分 材料与方法 | 第33-49页 |
| ·材料 | 第33-36页 |
| ·菌株和质粒 | 第33-34页 |
| ·菌株 | 第33页 |
| ·质粒 | 第33-34页 |
| ·培养基 | 第34页 |
| ·试剂和工具酶 | 第34页 |
| ·仪器和设备 | 第34-35页 |
| ·主要缓冲液 | 第35-36页 |
| ·质粒提取用缓冲液 | 第35页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳缓冲液 | 第35页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞制备用缓冲液 | 第35-36页 |
| ·蛋白质提取用缓冲液 | 第36页 |
| ·毕赤酵母转化与表达 | 第36页 |
| ·实验方法 | 第36-49页 |
| ·目的基因Sso-I-SceI、I-SceI-Sso、I-SceI的合成 | 第36-41页 |
| ·合成基因所需引物的设计 | 第36-39页 |
| ·PCR扩增片段 | 第39-40页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 | 第40页 |
| ·vita-gene胶回收试剂盒回收DNA | 第40-41页 |
| ·Over-lapping PCR扩片段 | 第41页 |
| ·PCR产物的T4 DNA聚合酶处理 | 第41页 |
| ·毕赤酵母重组表达载体的构建 | 第41-44页 |
| ·双酶切pHBM905A质粒 | 第41-42页 |
| ·solution Ⅰ酶连 | 第42-43页 |
| ·PCR鉴定重组质粒 | 第43-44页 |
| ·毕赤酵母的电击转化及重组菌株的鉴定 | 第44-45页 |
| ·限制性内切酶SalI处理重组质粒 | 第44页 |
| ·毕赤酵母的电击转化 | 第44-45页 |
| ·重组子的验证 | 第45页 |
| ·重组限制性内切酶Sso-I-SceI,I-SceI-Sso和I-SceI的诱导表达及SDS-PAGE分析 | 第45-47页 |
| ·外源基因在毕赤酵母中的高密度诱导表达 | 第45-46页 |
| ·SDS-PAGE检测表达蛋白 | 第46-47页 |
| ·Bradford法测定蛋白质浓度测定 | 第47-48页 |
| ·DNA质粒浓度的测定 | 第48页 |
| ·糖基化分析 | 第48-49页 |
| 第三部分 结果与分析 | 第49-61页 |
| ·重组限制性内切酶基因Sso-I-SceI,I-SceI-Sso,I-SceI的构建 | 第49-51页 |
| ·毕赤酵母重组表达载体的构建 | 第51-52页 |
| ·毕赤酵母的电击转化和重组菌株的鉴定 | 第52-54页 |
| ·重组限制性内切酶基因Sso-I-SceI,I-SceI-Sso,I-SceI的诱导表达和SDS-PAGE分析 | 第54-55页 |
| ·重组限制性内切酶基因Sso-I-SceI,I-SceI-Sso,I-SceI的蛋白质浓度测定 | 第55-56页 |
| ·重组限制性内切酶基因Sso-I-SceI,I-SceI-Sso,I-SceI的酶活性和比活性测定 | 第56-59页 |
| ·用于酶切的质粒Fast-spec介绍 | 第56-57页 |
| ·实验方法 | 第57-58页 |
| ·结果分析 | 第58-59页 |
| ·重组限制性内切酶基因Sso-I-SceI,I-SceI-Sso,I-SceI的纯度分析 | 第59-60页 |
| ·重组限制性内切酶基因Sso-I-SceI,I-SceI-Sso,I-SceI的糖基化分析 | 第60-61页 |
| 第四部分 讨论与展望 | 第61-63页 |
| ·讨论 | 第61页 |
| ·展望 | 第61-63页 |
| ·筛选高表达的菌株 | 第61-62页 |
| ·对融合有Sso7d的I-SceI酶性质研究 | 第62页 |
| ·对目的蛋白进行糖基化分析 | 第62-63页 |
| 参考文献 | 第63-70页 |
| 致谢 | 第70页 |
