| 摘要 | 第1-13页 |
| ABSTRACT | 第13-16页 |
| 缩写的中英文对照 | 第16-17页 |
| 第一篇 文献综述 | 第17-31页 |
| 1 大肠杆菌O157:H7研究进展 | 第17-24页 |
| ·病原学 | 第17-18页 |
| ·流行病学 | 第18-19页 |
| ·致病因子 | 第19-21页 |
| ·转位紧密粘附素受体(Tir) | 第19-20页 |
| ·志贺毒素 | 第20-21页 |
| ·研制中的疫苗 | 第21-24页 |
| ·单位疫苗 | 第21-22页 |
| ·Stx类毒素疫苗 | 第22页 |
| ·多糖结合疫苗 | 第22页 |
| ·重组活载体疫苗 | 第22-23页 |
| ·细菌ghost疫苗 | 第23页 |
| ·核酸疫苗 | 第23页 |
| ·转基因植物疫苗 | 第23-24页 |
| 2 粘膜免疫佐剂研究进展 | 第24-27页 |
| ·Zot的发现 | 第24-25页 |
| ·Zot的作用机制 | 第25页 |
| ·Zot作为粘膜免疫佐剂的前景 | 第25-27页 |
| 参考文献 | 第27-31页 |
| 第二篇 试验研究 | 第31-91页 |
| 第一章 肠出血性大肠杆菌O157:H7 tir基因重组蛋白的表达及鉴定 | 第31-45页 |
| 1 材料与方法 | 第32-39页 |
| ·材料 | 第32-33页 |
| ·菌种和质粒 | 第32页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第32页 |
| ·实验动物 | 第32-33页 |
| ·引物设计 | 第33页 |
| ·EHEC O157:H7基因组DNA提取 | 第33页 |
| ·PCR反应及电泳 | 第33-34页 |
| ·PCR扩增产物的回收 | 第34页 |
| ·pET28-tir重组质粒的构建 | 第34-36页 |
| ·目的片段和载体酶切 | 第34页 |
| ·连接体系 | 第34页 |
| ·感受态细胞制备 | 第34-35页 |
| ·转化 | 第35页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第35-36页 |
| ·pET28-tir重组菌构建 | 第36页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第36页 |
| ·连接产物转化 | 第36页 |
| ·阳性克隆的鉴定 | 第36页 |
| ·His-Tir融合蛋白的表达 | 第36-37页 |
| ·重组菌的培养 | 第36-37页 |
| ·重组菌的诱导 | 第37页 |
| ·融合蛋白表达形式的SDS-PAGE鉴定 | 第37页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第37-38页 |
| ·Western blot鉴定 | 第38-39页 |
| ·兔抗血清的制备 | 第38页 |
| ·Western blot | 第38-39页 |
| 2 结果 | 第39-40页 |
| ·目的基因获取 | 第39页 |
| ·BL21(pET28a-tir)重组菌构建 | 第39-40页 |
| ·BL21(pET28a-tir)重组菌表达 | 第40页 |
| 3 结论和讨论 | 第40-42页 |
| 参考文献 | 第42-45页 |
| 第二章 大肠杆菌O157:H7 Tir重组蛋白的生物学特性 | 第45-57页 |
| 1 材料和方法 | 第45-49页 |
| ·试剂 | 第45-46页 |
| ·菌株和细胞 | 第46页 |
| ·实验动物 | 第46页 |
| ·动物免疫 | 第46-48页 |
| ·重组蛋白的制备 | 第46页 |
| ·实验动物的前处理 | 第46页 |
| ·免疫程序 | 第46-47页 |
| ·清抗体变化检测 | 第47页 |
| ·攻毒用EHEC O157:H7全菌制备 | 第47页 |
| ·免疫小鼠的攻菌保护 | 第47页 |
| ·粪便排菌检测 | 第47-48页 |
| ·细胞粘附和粘附抑制 | 第48-49页 |
| ·细菌培养 | 第48页 |
| ·细胞培养 | 第48页 |
| ·粘附试验 | 第48页 |
| ·粘附抑制试验 | 第48页 |
| ·粘附计数 | 第48-49页 |
| ·肌动蛋白荧光染色(Fluorescein actin staining,FAS) | 第49页 |
| 2 结果 | 第49-52页 |
| ·免疫后小鼠血清中Tir特异性抗体的检测 | 第49页 |
| ·攻毒后小鼠免疫保护性测定 | 第49-50页 |
| ·存活率 | 第49页 |
| ·攻毒后排菌情况检测 | 第49-50页 |
| ·Tir重组蛋白抗血清对EHEC粘附上皮细胞的影响 | 第50-51页 |
| ·Tir重组蛋白抗血清对EHEC造成A/E损伤的影响 | 第51-52页 |
| 3 讨论 | 第52-54页 |
| 参考文献 | 第54-57页 |
| 第三章 肠出血性大肠杆菌O157:H7 Stx2B-Tir-Stx1B-Zot多价融合蛋白表达及鉴定 | 第57-81页 |
| 1 材料与方法 | 第58-71页 |
| ·材料 | 第58-59页 |
| ·菌种和质粒 | 第58页 |
| ·主要试剂和仪器 | 第58-59页 |
| ·实验动物 | 第59页 |
| ·引物设计 | 第59页 |
| ·EHEC O157:H7基因组DNA提取 | 第59页 |
| ·PCR反应及电泳 | 第59-63页 |
| ·stx2b基因和stx1b基因PCR扩增及电泳 | 第59-61页 |
| ·tir基因的PCR扩增及电泳 | 第61页 |
| ·stx1b-tir串联基因的PCR扩增及电泳 | 第61-62页 |
| ·zot PCR扩增 | 第62-63页 |
| ·PCR扩增产物的回收 | 第63页 |
| ·tir-stx1b的AT克隆与鉴定 | 第63-65页 |
| ·tir-stx1b与pMD18-T载体连接 | 第63页 |
| ·感受态细胞制备 | 第63-64页 |
| ·转化 | 第64页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第64-65页 |
| ·pGEX-4T-1-stx2b重组质粒构建 | 第65-66页 |
| ·pGEX-4T-1与stx2b的连接 | 第65页 |
| ·感受态细胞制备 | 第65页 |
| ·转化 | 第65页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第65-66页 |
| ·pGEX-4-1-stx2b-tir-stx1b重组质粒构建 | 第66-67页 |
| ·pGEX-4T-1-stx2b与pMD18-tir-stx1b的酶切 | 第66页 |
| ·酶切片段的回收 | 第66页 |
| ·pGEX-4-1-stx2b与tir-stx1b的连接 | 第66-67页 |
| ·感受态细胞制备 | 第67页 |
| ·转化 | 第67页 |
| ·重组质粒鉴定 | 第67页 |
| ·pGEX-4-1-stx2b-tir-stx1b-zot重组质粒构建 | 第67-69页 |
| ·pGEX-4T-1-stx2b-tir-stx1b与zot PCR酶切 | 第67-68页 |
| ·酶切片段的回收 | 第68页 |
| ·pGEX-4T-1-stx2b-tir-stx1b酶切片段的去磷酸化 | 第68页 |
| ·pGEX-4T-1-stx2b-tir-stx1b与zot连接 | 第68页 |
| ·感受态细胞制备 | 第68页 |
| ·转化 | 第68页 |
| ·重组质粒鉴定 | 第68-69页 |
| ·BL21(pGEX-4T-1-stx2b-tir-stx1b-zot)重组菌的表达 | 第69-70页 |
| ·重组菌的培养 | 第69页 |
| ·重组菌的诱导 | 第69页 |
| ·融合蛋白表达形式的SDS-PAGE鉴定 | 第69页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第69-70页 |
| ·Western blot鉴定 | 第70-71页 |
| ·兔抗血清的制备 | 第70页 |
| ·Western blot | 第70-71页 |
| 2 结果 | 第71-76页 |
| ·目的基因获取 | 第71-73页 |
| ·BL21(pGEX-4T-stx2b-tir-stx1b-zot)重组菌构建 | 第73-74页 |
| ·Top10(pMD18-T-tir-stx1b)重组菌构建 | 第73页 |
| ·Top10(pGEX-4T-stx2b-tir-stx1b)重组菌构建 | 第73页 |
| ·BL21(pGEX-4T-stx2b-tir-stx1b-zot)重组菌构建 | 第73-74页 |
| ·BL21(pGEX-4T-stx2b-tir-stx1b-zot)重组菌表达 | 第74-76页 |
| 3 结论和讨论 | 第76-78页 |
| 参考文献 | 第78-81页 |
| 第四章 大肠杆菌O157:H7 Stx2B-Tir-Stx1B-Zot重组蛋白的免疫原性 | 第81-91页 |
| 1 材料和方法 | 第81-84页 |
| ·试剂及实验动物 | 第81-82页 |
| ·重组蛋白和攻毒用菌株 | 第82页 |
| ·皮下免疫 | 第82-83页 |
| ·重组蛋白的制备 | 第82页 |
| ·免疫程序 | 第82页 |
| ·血清IgG滴度测定 | 第82-83页 |
| ·血清和粪便中IgA滴度测定 | 第83页 |
| ·鼻腔免疫 | 第83页 |
| ·重组蛋白的制备 | 第83页 |
| ·免疫程序 | 第83页 |
| ·血清IgG滴度测定 | 第83页 |
| ·血清和粪便中sIgA滴度测定 | 第83页 |
| ·鼻腔免疫和皮下免疫小鼠攻毒实验 | 第83-84页 |
| ·实验动物的前处理 | 第83-84页 |
| ·攻毒用EHEC O157:H7全菌制备 | 第84页 |
| ·免疫小鼠的攻毒 | 第84页 |
| ·粪便排菌检测 | 第84页 |
| 2 结果 | 第84-87页 |
| ·皮下免疫和鼻腔免疫后血清中IgG滴度测定 | 第84-85页 |
| ·血清和粪便中IgA滴度测定 | 第85-86页 |
| ·攻毒后小鼠免疫保护性测定 | 第86-87页 |
| ·小鼠存活率 | 第86页 |
| ·攻毒后排菌情况检测 | 第86-87页 |
| 3 讨论 | 第87-89页 |
| 参考文献 | 第89-91页 |
| 全文结论 | 第91-93页 |
| 本文创新点 | 第93-95页 |
| 附录:常用试剂的配制 | 第95-99页 |
| 致谢 | 第99-101页 |
| 攻读学位期间发表的主要学术论文目录 | 第101页 |
