| 摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-15页 |
| 前言 | 第15-36页 |
| 1.真核基因的分布及表达调控的特点 | 第15-21页 |
| ·真核基因在染色体上成簇分布 | 第15-16页 |
| ·转录共调控是成簇基因表达调控的普遍形式 | 第16-18页 |
| ·三维构象及核分区是成簇基因表达调控的高级形式 | 第18-19页 |
| ·looping是基因表达激活的一种方式 | 第19-21页 |
| 2.β珠蛋白基因簇是研究成簇基因表达调控的经典模型 | 第21-27页 |
| ·鼠β珠蛋白基因簇的结构特点 | 第21-22页 |
| ·远距离增强元件LCR的功能特点 | 第22-23页 |
| ·远距离增强元件LCR的作用机制 | 第23-27页 |
| 3.转录因子NF-E2在β-珠蛋白基因簇表达调控中具有重要作用 | 第27-35页 |
| ·NF-E2的结构及分布特点 | 第27-29页 |
| ·NF-E2的功能特点 | 第29-32页 |
| ·NF-E2的结合激活珠蛋白基因的表达 | 第29-30页 |
| ·NF-E2的结合引起β珠蛋白基因簇组蛋白修饰的变化 | 第30-31页 |
| ·NF-E2的结合引起RNA Pol Ⅱ从LCR区转移到珠蛋白基因β-maj启动子区。 | 第31-32页 |
| ·NF-E2的结合伴随着β珠蛋白基因簇核定位的改变 | 第32-33页 |
| ·红系分化过程中NF-E2在β珠蛋白基因簇上的结合模式 | 第33-35页 |
| 4.本研究的主要内容 | 第35-36页 |
| 材料与方法 | 第36-55页 |
| 1.实验材料 | 第36-38页 |
| ·本研究中所用合成siRNA的DNA序列 | 第36页 |
| ·菌株与质粒 | 第36页 |
| ·细胞系 | 第36页 |
| ·限制性内切酶及修饰酶 | 第36页 |
| ·抗体 | 第36-37页 |
| ·其它主要试剂 | 第37页 |
| ·主要仪器设备 | 第37-38页 |
| 2.实验方法 | 第38-55页 |
| ·基本技术路线 | 第38-39页 |
| ·质粒的构建 | 第39-42页 |
| ·限制性内切酶酶切反应 | 第39页 |
| ·DNA片段回收 | 第39页 |
| ·DNA片段3'凸端的削平 | 第39页 |
| ·载体的脱磷酸化 | 第39-40页 |
| ·连接反应 | 第40页 |
| ·感受态大肠杆菌细胞制备 | 第40页 |
| ·转化 | 第40-41页 |
| ·质粒DNA的小量制备 | 第41页 |
| ·质粒(BAC)DNA的大量制备 | 第41-42页 |
| ·细胞培养 | 第42-43页 |
| ·细胞的生长条件 | 第42页 |
| ·细胞的传代 | 第42页 |
| ·细胞的复苏及冻存 | 第42页 |
| ·G418溶液的配制 | 第42-43页 |
| ·病毒包装与转导靶细胞 | 第43页 |
| ·脂质体法转染GP-293细胞 | 第43页 |
| ·病毒上清收集及冻存 | 第43页 |
| ·病毒转导靶细胞 | 第43页 |
| ·DMSO诱导DS19,DS19sip18细胞分化 | 第43页 |
| ·半定量RT PCR和real-time PCR | 第43-45页 |
| ·RNA的提取 | 第43-44页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第44页 |
| ·RT PCR | 第44页 |
| ·Real-time PCR | 第44-45页 |
| ·Western Blot分析 | 第45-48页 |
| ·裂解细胞 | 第45页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第45-46页 |
| ·SDS-PAGE | 第46页 |
| ·转膜 | 第46-47页 |
| ·抗原抗体反应 | 第47页 |
| ·辣根过氧化物酶化学发光法 | 第47-48页 |
| ·染色质免疫沉淀分析(ChIp) | 第48-51页 |
| ·细胞培养 | 第48页 |
| ·固定 | 第48页 |
| ·全细胞抽提物(WCE)的获得 | 第48-49页 |
| ·免疫沉淀 | 第49页 |
| ·DNA的分离及纯化 | 第49页 |
| ·半定量PCR反应 | 第49-51页 |
| ·染色质构象定量分析(3C) | 第51-55页 |
| ·交联固定的细胞核的制备 | 第51页 |
| ·细胞裂解与细胞核的分离 | 第51页 |
| ·台盼蓝染色检测细胞裂解情况 | 第51页 |
| ·非特异结合蛋白的洗脱与SDS的中和 | 第51页 |
| ·细胞核的保存 | 第51页 |
| ·细胞核内染色质DNA限制性内切酶的消化与鉴定 | 第51-52页 |
| ·交联固定的染色质复合物内DNA分子的连接 | 第52页 |
| ·连接产物DNA模板的制备与定量 | 第52页 |
| ·对照模板的制备与分析 | 第52-53页 |
| ·连接产物DNA线性扩增范围的确定 | 第53页 |
| ·定量分析连接效率 | 第53-55页 |
| 实验结果 | 第55-77页 |
| 1.DS19 细胞系中NF-E2 p18亚基的沉默 | 第55-64页 |
| ·RNAi干扰靶点的选择 | 第55页 |
| ·pBS/U6-sip18载体的构建 | 第55-58页 |
| ·PXRNU6-sip18载体的构建 | 第58-61页 |
| ·重组病毒的产生与收集 | 第61页 |
| ·抗性细胞克隆库的形成 | 第61页 |
| ·RT PCR检测抗性细胞库中NF-E2p18的表达 | 第61-62页 |
| ·Western blotting检测DS19sip18细胞中NF-E2p18蛋白的表达 | 第62-63页 |
| ·影响逆转录病毒介导的RNA干扰效率的因素 | 第63-64页 |
| 2.鉴定RNA干扰后NF-E2因子体内的功能 | 第64-70页 |
| ·NF-E2p18小亚基干扰后珠蛋白基因表达的变化 | 第64-66页 |
| ·RT半定量PCR检测珠蛋白基因的表达 | 第64-65页 |
| ·Real-time PCR检测珠蛋白基因的表达 | 第65-66页 |
| ·DNA结合能力的变化 | 第66-70页 |
| ·超声波破碎细胞核 | 第66-67页 |
| ·PCR扩增模板量的选择 | 第67页 |
| ·NF-E2 p18、p45在LCR及β珠蛋白基因启动子区的结合 | 第67-70页 |
| 3.检测NF-E2因子干扰后珠蛋白基因启动子区RNA Pol Ⅱ的结合状态 | 第70-71页 |
| 4.染色质构象捕获技术检测NF-E2干扰后珠蛋白基因簇染色质构象的变化 | 第71-77页 |
| ·交联染色质复合物酶切效率的鉴定 | 第71-72页 |
| ·定量分析的引物的鉴定 | 第72-73页 |
| ·PCR扩增选择适宜模板浓度 | 第73-74页 |
| ·以HS2为引领引物检测NF-E2干扰前后珠蛋白基因簇染色质空间构象的变化。 | 第74-77页 |
| 讨论 | 第77-89页 |
| 1.转录因子NF-E2与珠蛋白基因的表达 | 第77-80页 |
| ·转录因子NF-E2p18小亚基的沉默影响珠蛋白基因的表达 | 第77-79页 |
| ·β-珠蛋白基因的转录激活与NF-E2在β珠蛋白基因簇上的结合相关 | 第79-80页 |
| 2.NF-E2参与looping的形成 | 第80-83页 |
| ·β-珠蛋白基因簇通过looping的方式激活珠蛋白基因的表达 | 第80-81页 |
| ·参与looping形成的重要调控元件及反式作用因子 | 第81-82页 |
| ·NF-E2可能是参与looping形成的转录因子之一 | 第82-83页 |
| 3.转录因子NF-E2的募集与RNA Pol Ⅱ的结合相关。 | 第83-84页 |
| 4.NF-E2参与β珠蛋白基因转录激活过程的研究 | 第84-85页 |
| 5.NF-E2参与β珠蛋白基因转录激活过程的假说 | 第85-88页 |
| 6.今后的工作展望 | 第88-89页 |
| 小结 | 第89-91页 |
| 参考文献 | 第91-110页 |
| 英文名词及缩写 | 第110-112页 |
| 致献 | 第112-113页 |
| 个人简历 | 第113页 |
