| 致谢 | 第1-13页 |
| 缩略词 | 第13-14页 |
| 摘要 | 第14-16页 |
| ABSTRACT | 第16-20页 |
| 引言 | 第20-23页 |
| 第一章 文献综述 | 第23-68页 |
| 第一节 稻瘟病与稻瘟病菌 | 第23-42页 |
| 1 稻瘟病菌的侵染循环 | 第23-25页 |
| 2 稻瘟病菌附着胞形成 | 第25-27页 |
| 3 侵染栓的形成和侵入 | 第27页 |
| 4 稻瘟病菌附着胞形成过程中的相关基因 | 第27-33页 |
| ·参与表面识别的基因 | 第28-29页 |
| ·黑色素相关基因 | 第29-30页 |
| ·产孢相关基因 | 第30-31页 |
| ·甘油合成相关基因 | 第31-33页 |
| 5 稻瘟病菌信号传导途径 | 第33-42页 |
| ·G蛋白耦连的信号途径 | 第33页 |
| ·环化腺苷酸(cAMP)信号途径 | 第33-36页 |
| ·MAPK(mitogen-activated protein kinase)信号传导途径 | 第36-38页 |
| ·Ca~(2+)离子途径 | 第38-39页 |
| ·其它致病性相关的基因 | 第39-42页 |
| 第二节 细胞自噬的研究进展 | 第42-54页 |
| 1 细胞自噬的类型 | 第42-43页 |
| 2 细胞自噬的研究方法 | 第43-45页 |
| ·形态学方法 | 第43-44页 |
| ·细胞自噬的特异标志物 | 第44-45页 |
| ·特异抑制剂 | 第45页 |
| 3 细胞自噬的分子机制 | 第45-54页 |
| ·细胞自噬的诱导 | 第46-47页 |
| ·自噬体的形成 | 第47-52页 |
| ·自噬过程的信号调控 | 第52-54页 |
| 第三节 双分子荧光互补技术在研究蛋白质相互作用的应用 | 第54-59页 |
| 1 BiFC原理 | 第54-55页 |
| ·荧光蛋白的结构与特性 | 第54-55页 |
| ·BiFC技术的基本原理 | 第55页 |
| 2 BiFC技术的基本实验操作 | 第55-56页 |
| 3 BiFC的应用 | 第56-59页 |
| ·研究转录因子间的相互作用及其亚细胞定位 | 第56-57页 |
| ·利用BiFC寻找G蛋白可能存在相互作用的β和γ亚基 | 第57页 |
| ·检测泛素化途径 | 第57-58页 |
| ·利用多色荧光互补技术同时检测多种蛋白质间的相互作用 | 第58-59页 |
| 第四节 Pichia酵母系统在蛋白表达中的应用 | 第59-65页 |
| 1 常用表达菌株 | 第59页 |
| 2 巴斯德酵母表达载体 | 第59-60页 |
| 3 外源基因的转化和整合 | 第60-61页 |
| ·毕赤酵母转化方法 | 第60-61页 |
| ·外源基因的整合方式 | 第61页 |
| ·筛选高拷贝的方法 | 第61页 |
| 4 外源基因在毕赤酵母中的高效表达 | 第61-65页 |
| ·外源基因的性质 | 第61-62页 |
| ·培养条件 | 第62-63页 |
| ·蛋白酶的降解 | 第63页 |
| ·表达产物的糖基化 | 第63-64页 |
| ·外源蛋白的翻译后修饰 | 第64-65页 |
| 第五节 本研究的目的内容及技术路线 | 第65-68页 |
| 第二章 材料与方法 | 第68-109页 |
| 1 试验材料 | 第68-74页 |
| ·试验菌株 | 第68页 |
| ·质粒载体 | 第68页 |
| ·文库 | 第68页 |
| ·供试植物 | 第68页 |
| ·仪器 | 第68-69页 |
| ·试剂 | 第69页 |
| ·培养基 | 第69-74页 |
| ·稻瘟病菌培养基 | 第69-71页 |
| ·大肠杆菌培养基 | 第71-72页 |
| ·酵母(毕赤酵母)培养基 | 第72-74页 |
| ·毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制 | 第74页 |
| 2 试验方法 | 第74-109页 |
| ·PCR | 第74-76页 |
| ·常规PCR | 第74-75页 |
| ·LD-PCR(长距离PCR) | 第75页 |
| ·酵母菌落PCR | 第75-76页 |
| ·DNA操作 | 第76-80页 |
| ·质粒提取 | 第76-78页 |
| ·质粒酶切 | 第78-79页 |
| ·酶切片段的去磷酸化(CIP) | 第79页 |
| ·琼脂糖电泳 | 第79-80页 |
| ·DNA片段的凝胶回收 | 第80页 |
| ·连接反应 | 第80页 |
| ·质粒转化 | 第80-82页 |
| ·E.coli DH5α感受态细胞的制备 | 第80-81页 |
| ·感受态细胞转化 | 第81-82页 |
| ·X-gal和IPTG直接用于琼脂平板 | 第82页 |
| ·阳性克隆子的鉴定 | 第82页 |
| ·稻瘟病菌基因组DNA提取 | 第82-83页 |
| ·菌丝培养 | 第82页 |
| ·基因组DNA的提取(CTAB法) | 第82-83页 |
| ·稻瘟病菌RNA提取与分析 | 第83-85页 |
| ·稻瘟病菌原生质体的制备与转化 | 第85-86页 |
| ·原生质体的制备 | 第85-86页 |
| ·稻瘟病菌原生质体的转化(室温或者冰上) | 第86页 |
| ·溶液及培养基配方 | 第86页 |
| ·稻瘟病菌基因组DNA Southern杂交 | 第86-90页 |
| ·DIG-DNA标记 | 第86-87页 |
| ·基因组DNA的消化、电泳及变性 | 第87页 |
| ·DNA转膜 | 第87-88页 |
| ·Southern杂交过程 | 第88页 |
| ·免疫显色 | 第88-89页 |
| ·所需试剂 | 第89-90页 |
| ·荧光观察 | 第90页 |
| ·突变体表性分析 | 第90-91页 |
| ·生长速率测定 | 第90页 |
| ·产孢量分析 | 第90页 |
| ·孢子发芽率测定 | 第90页 |
| ·孢子附着胞形成率分析 | 第90页 |
| ·附着胞膨压分析 | 第90-91页 |
| ·有性杂交分析 | 第91页 |
| ·细胞自噬的观察 | 第91页 |
| ·致病性分析 | 第91-92页 |
| ·大麦离体接种试验 | 第91页 |
| ·水稻喷雾接种 | 第91-92页 |
| ·透射电镜样品制备 | 第92页 |
| ·酵母互补分析 | 第92-95页 |
| ·酵母感受态的制备与转化 | 第92-95页 |
| ·酵母菌落PCR | 第95页 |
| ·酵母MgATG4互补突变体的饥饿诱导 | 第95页 |
| ·双分子荧光互补分析 | 第95-96页 |
| ·载体构建 | 第95-96页 |
| ·原生质体共转化 | 第96页 |
| ·MgATG4基因的定点突变 | 第96-98页 |
| ·构建蛋白表达载体 | 第96页 |
| ·引物设计: | 第96页 |
| ·PCR定点突变: | 第96-97页 |
| ·DpnI处理酶切产物: | 第97页 |
| ·转化酶切产物: | 第97-98页 |
| ·毕赤酵母蛋白表达菌株活化 | 第98页 |
| ·酵母菌株的分离纯化 | 第98页 |
| ·pPICZαA原核宿主菌TOP10F'的活化培养 | 第98页 |
| ·毕赤酵母表达的试验方法 | 第98-100页 |
| ·质粒DNA的线性化处理 | 第98-99页 |
| ·毕赤酵母电转化菌体的准备 | 第99页 |
| ·电击转化 | 第99页 |
| ·确定转化子的Mut表型 | 第99-100页 |
| ·Zeo~R转化子的PCR验证 | 第100页 |
| ·Mut~+表型重组酵母的诱导表达实验 | 第100页 |
| ·蛋白质电泳(Tricine-SDS-PAGE)及杂交 | 第100-106页 |
| ·蛋白质电泳及杂交试: | 第100-103页 |
| ·凝胶的制备 | 第103页 |
| ·样品准备(TCA沉淀蛋白方法) | 第103-104页 |
| ·上样电泳 | 第104页 |
| ·考马斯亮蓝染色与脱色 | 第104页 |
| ·蛋白质杂交 | 第104-106页 |
| ·蛋白的大量表达与纯化 | 第106-108页 |
| ·蛋白的大量表达 | 第106页 |
| ·蛋白浓缩(硫酸铵沉淀法) | 第106-108页 |
| ·蛋白酶切试验 | 第108-109页 |
| 第三章 细胞自噬基因MgATG4的表达模式及功能研究 | 第109-134页 |
| 1 MgATG4基因的克隆与鉴定 | 第109-111页 |
| ·MgATG4基因的PCR扩增结果 | 第109页 |
| ·重组质粒的酶切验证 | 第109页 |
| ·测序结果与序列分析 | 第109-111页 |
| 2 MgATG4基因与酵母ATG4基因同源性分析 | 第111-114页 |
| 3 MgATG4的表达模式分析 | 第114-120页 |
| ·MgATG4的时间表达模式 | 第114-116页 |
| ·通用载体pEGFP-HPH的构建 | 第114-115页 |
| ·pMgATG4(p)-GFP融合载体的构建 | 第115-116页 |
| ·MgATG4在孢子、菌丝及附着胞中均有表达 | 第116页 |
| ·MgATG4基因的空间表达分析 | 第116-120页 |
| ·MgATG4-GFP融合载体的构建 | 第116-119页 |
| ·MgATG4蛋白的细胞定位 | 第119-120页 |
| 4 MgATG4基因缺失突变体及互补转化子的获得 | 第120-125页 |
| ·MgATG4基因敲除载体的构建 | 第120-121页 |
| ·Δmgatg4突变体的获得 | 第121-123页 |
| ·互补载体的构建 | 第123页 |
| ·RT-PCR验证 | 第123-125页 |
| 5 突变体表型分析 | 第125-133页 |
| ·突变体菌落形态 | 第125页 |
| ·突变体Δmgatg4产孢量明显下降 | 第125-126页 |
| ·交配试验 | 第126页 |
| ·孢子萌发与附着胞形成 | 第126-127页 |
| ·附着胞膨压下降 | 第127-128页 |
| ·突变体Δmgatg4对饥饿敏感 | 第128-129页 |
| ·突变体Δmgatg4的细胞自噬过程中断 | 第129-130页 |
| ·突变体Δmgatg4致病性丧失 | 第130-133页 |
| ·离体接种 | 第130页 |
| ·喷雾接种 | 第130页 |
| ·致病机理研究 | 第130-133页 |
| 6 本章小结 | 第133-134页 |
| 第四章 利用BiFC检测MgATG4与MgATG8的体内互作研究 | 第134-144页 |
| 1 MgATG8基因的克隆与鉴定 | 第134页 |
| 2 MgATG8基因的时间表达模式 | 第134-137页 |
| ·pMgATG8(p)-GFP融合载体的构建 | 第134-135页 |
| ·MgATG8在孢子、附着胞及菌丝中均有表达 | 第135-137页 |
| 3 BiFC表达载体的构建 | 第137-143页 |
| ·MgATG4(p)-ATG4-YFPN表达载体的构建 | 第138-139页 |
| ·阴性对照载体的构建 | 第139页 |
| ·MgATG4(p)-YFPC-ATG8表达载体的构建 | 第139-141页 |
| ·表达载体的共转化及转化子筛选 | 第141页 |
| ·转化子的Southern blot鉴定 | 第141页 |
| ·YFP荧光的检测 | 第141-143页 |
| 4 小结 | 第143-144页 |
| 第五章 MgATG4、MgATG8在毕赤酵母中的表达及MgATG4活性位点研究 | 第144-159页 |
| 1 MgATG4、MgATG8基因毕赤酵母表达载体的构建 | 第144-147页 |
| ·MgATG4和MgATG8基因的克隆 | 第144页 |
| ·pPICZα-ATG4和pPICZα-ATG8表达载体的构建 | 第144页 |
| ·pPICZα-ATG4和pPICZα-ATG8表达载体的酶切验证 | 第144-147页 |
| 2 MgATG4基因半胱氨酸位点的突变 | 第147-152页 |
| ·MgATG4保守半胱氨酸的确定 | 第147-148页 |
| ·定点突变引物的设计 | 第148页 |
| ·基因定点突变反应 | 第148-149页 |
| ·基因点突变鉴定 | 第149-150页 |
| ·突变测序结果 | 第150-152页 |
| 3 MgATG4、MgATG8在毕赤酵母中的分泌表达 | 第152-157页 |
| ·毕赤酵母转化子的筛选 | 第152-153页 |
| ·MMH和MDH培养基筛选 | 第152页 |
| ·PCR验证 | 第152-153页 |
| ·MgATG4和MgATG8在毕赤酵母中的分泌表达和鉴定 | 第153-155页 |
| ·表达上清电泳及Weastern blot检测 | 第153-155页 |
| ·表达蛋白的分析 | 第155页 |
| ·融合蛋白的大量表达及纯化 | 第155-156页 |
| ·MgATG4半胱氨酸活性位点的确定 | 第156-157页 |
| 4 本章小结 | 第157-159页 |
| 第六章 全文讨论及后续研究展望 | 第159-167页 |
| 1 全文讨论 | 第159-165页 |
| ·细胞自噬相关基因启动子的表达调控 | 第159-161页 |
| ·细胞自噬过程是进化上高度保守的过程 | 第161页 |
| ·细胞自噬是真菌发育所必需的过程 | 第161-162页 |
| ·细胞自噬是稻瘟病菌致病性所必需的过程 | 第162-163页 |
| ·MgATG4与MgATG8在饥饿诱导条件下相互作用增强 | 第163-164页 |
| ·MgATG4蛋白活性位点是高度保守的 | 第164-165页 |
| 2 本研究的创新点 | 第165页 |
| 3 后续研究展望 | 第165-167页 |
| 参考文献 | 第167-178页 |
| 附录 | 第178-180页 |
| 附录1:本研究中所使用的引物 | 第178-179页 |
| 附录2:博士期间发表的论文 | 第179-180页 |
| 作者简介 | 第180页 |
