| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第一部分 文献综述 | 第12-26页 |
| 第一章 双分子荧光互补 | 第12-17页 |
| 1 BiFC的介绍 | 第12-14页 |
| 2 BiFC的应用 | 第14-17页 |
| 第二章 PUF蛋白的研究进展 | 第17-24页 |
| 1 PUF蛋白研究进展 | 第18-24页 |
| 1.1 结构研究进展 | 第18-20页 |
| 1.2 功能及机制研究进展 | 第20-23页 |
| 1.3 PUF在植物中的研究进展 | 第23-24页 |
| 第三章 本课题研究目的及意义 | 第24-25页 |
| 技术路线 | 第25-26页 |
| 第二部分 研究内容 | 第26-78页 |
| 第一章 双分子荧光互补体系的构建 | 第26-52页 |
| 1 前言 | 第26-27页 |
| 2 材料与方法 | 第27-43页 |
| 2.1 实验试剂与仪器 | 第27页 |
| 2.2 菌株与载体 | 第27页 |
| 2.3 实验方法 | 第27-36页 |
| 2.3.1 相关引物设计 | 第27-30页 |
| 2.3.2 感受态细胞的制备 | 第30-31页 |
| 2.3.3 质粒的提取 | 第31-32页 |
| 2.3.4 PCR扩增YFP的N端和C端、PUF1 | 第32页 |
| 2.3.5 PCR产物的处理 | 第32-33页 |
| 2.3.6 加A处理 | 第33页 |
| 2.3.7 TA连接与转化 | 第33-34页 |
| 2.3.8 酶切 | 第34-35页 |
| 2.3.9 产物割胶回收 | 第35-36页 |
| 2.3.10 T4连接与转化 | 第36页 |
| 2.4 pET-24a-CEYFP-PUF1、His9-PUF2-NEYFP蛋白的表达与纯化 | 第36-38页 |
| 2.4.1 Ni柱纯化蛋白的原理 | 第36页 |
| 2.4.2 融合蛋白的诱导表达 | 第36-37页 |
| 2.4.3 蛋白纯化 | 第37-38页 |
| 2.4.4 透析袋的处理方法 | 第38页 |
| 2.5 SDS-PAGE电泳检测 | 第38-40页 |
| 2.5.1 制胶 | 第38-39页 |
| 2.5.2 电泳 | 第39-40页 |
| 2.5.3 染色和脱色 | 第40页 |
| 2.6 蛋白浓度测定 | 第40-41页 |
| 2.6.1 所需试剂的配制 | 第40页 |
| 2.6.2 蛋白标准曲线的制作 | 第40-41页 |
| 2.6.3 样品浓度测定 | 第41页 |
| 2.7 体外BiFC实验 | 第41-42页 |
| 2.8 原核细胞内PUF结合mRNA实验 | 第42-43页 |
| 2.8.1 pET-PUF1载体的构建 | 第42页 |
| 2.8.2 pET-CcY-PUF1载体的构建 | 第42-43页 |
| 3 实验结果 | 第43-51页 |
| 3.1 NEYFP、CEYFP的扩增结果 | 第43-44页 |
| 3.2 PUF1、PUF2片段的获得 | 第44-45页 |
| 3.3 PUF1、pETDuet-1、pCcY-CFP-1-YFP酶切结果 | 第45-47页 |
| 3.4 蛋白表达纯化SDS-PAGE电泳图分析 | 第47-50页 |
| 3.4.1 pET-24a-CYFP-PUF1融合蛋白的表达与纯化 | 第47页 |
| 3.4.2 His9-PUF2-NYFP融合蛋白的表达与纯化 | 第47-48页 |
| 3.4.3 pET-CcY-PUF1蛋白的表达 | 第48-50页 |
| 3.4.4 蛋白浓度测定 | 第50页 |
| 3.5 体外BiFC实验 | 第50-51页 |
| 4 讨论 | 第51-52页 |
| 第二章 PUF蛋白在拟南芥中的研究 | 第52-67页 |
| 1 前言 | 第52页 |
| 2 材料与方法 | 第52-63页 |
| 2.1 植物材料与菌种 | 第52-53页 |
| 2.2 实验试剂和仪器 | 第53页 |
| 2.3 实验方法 | 第53-56页 |
| 2.3.1 酶切 | 第53页 |
| 2.3.2 割胶回收 | 第53-54页 |
| 2.3.3 连接 | 第54页 |
| 2.3.4 大肠杆菌感受态的制备 | 第54页 |
| 2.3.5 转化 | 第54页 |
| 2.3.6 阳性克隆的鉴定 | 第54-55页 |
| 2.3.7 GATEWAY反应 | 第55页 |
| 2.3.8 质粒提取 | 第55页 |
| 2.3.9 农杆菌感受态的制备 | 第55-56页 |
| 2.3.10 农杆菌热激转化 | 第56页 |
| 2.4 拟南芥的培养及种植 | 第56-57页 |
| 2.5 农杆菌介导的拟南芥花浸染法转基因及筛选方法 | 第57-58页 |
| 2.5.1 花浸染法转基因 | 第57-58页 |
| 2.5.2 转基因苗的筛选 | 第58页 |
| 2.5.3 稳定转基因遗传学材料的获得 | 第58页 |
| 2.6 Trizon法提取拟南芥RNA | 第58-59页 |
| 2.7 拟南芥cDNA的合成 | 第59-60页 |
| 2.8 荧光定量PCR分析 | 第60-61页 |
| 2.8.1 荧光定量PCR引物序列 | 第60-61页 |
| 2.8.2 荧光定量PCR反应体系 | 第61页 |
| 2.9 GUS染色 | 第61-63页 |
| 2.9.1 GUS染液的配制 | 第61-62页 |
| 2.9.2 拟南芥的GUS染色 | 第62-63页 |
| 3 实验结果 | 第63-65页 |
| 3.1 PCR验证结果 | 第63页 |
| 3.2 GUS染色结果 | 第63-64页 |
| 3.3 相关基因的表达 | 第64-65页 |
| 4 讨论 | 第65-67页 |
| 第三章 PUF蛋白在哺乳动物细胞内的研究 | 第67-78页 |
| 1 前言 | 第67页 |
| 2 材料与方法 | 第67-77页 |
| 2.1 细胞株及载体 | 第67页 |
| 2.2 实验试剂和仪器 | 第67-68页 |
| 2.3 实验方法 | 第68-77页 |
| 2.3.1 基因及相关引物合成 | 第68-70页 |
| 2.3.2 感受态E.coli DH5α的制备 | 第70页 |
| 2.3.3 质粒转化 | 第70页 |
| 2.3.4 质粒提取 | 第70-71页 |
| 2.3.5 质粒浓缩 | 第71页 |
| 2.3.6 226、227、229突变体的获得 | 第71-72页 |
| 2.3.7 细胞复苏 | 第72页 |
| 2.3.8 贴壁细胞传代 | 第72-73页 |
| 2.3.9 转染 | 第73-74页 |
| 2.3.10 细胞总RNA提取与逆转录 | 第74-76页 |
| 2.3.10.1 RNA提取 | 第74-75页 |
| 2.3.10.2 cDNA合成 | 第75-76页 |
| 2.3.11 qRT PCR检测细胞中HBZ的表达 | 第76-77页 |
| 3 实验结果 | 第77页 |
| 4 讨论 | 第77-78页 |
| 结论与展望 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-84页 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 | 第84-85页 |
| 致谢 | 第85-87页 |
