| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 目录 | 第5-7页 |
| 第一章 绪论 | 第7-13页 |
| ·苹果酸脱氢酶的理化性质和生物功能 | 第7-8页 |
| ·苹果酸脱氢酶的用途 | 第8页 |
| ·酶活力的影响因素 | 第8-9页 |
| ·重组蛋白在大肠杆菌pET系统中的表达 | 第9-10页 |
| ·耐热酶天然构象的耐热机制 | 第10-12页 |
| ·氨基酸组成 | 第10-11页 |
| ·疏水作用 | 第11页 |
| ·氢键 | 第11页 |
| ·离子网状结构 | 第11-12页 |
| ·苹果酸脱氢酶的热稳定性 | 第12页 |
| ·本课题的立题意义及其内容 | 第12-13页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第13-22页 |
| ·实验材料 | 第13-14页 |
| ·实验仪器 | 第13页 |
| ·实验材料 | 第13-14页 |
| ·实验方法 | 第14-22页 |
| ·大肠杆菌(Escherichia coli)JM109染色体的提取 | 第14页 |
| ·PCR引物的设计 | 第14-15页 |
| ·苹果酸脱氢酶编码基因的扩增体系及条件 | 第15页 |
| ·PCR产物与克隆载体pMD18-T的连接 | 第15页 |
| ·重组质粒pET-28a-mdh的构建 | 第15页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第15-16页 |
| ·转化大肠杆菌BL21感受态细胞 | 第16页 |
| ·重组质粒的提取及酶切验证 | 第16页 |
| ·苹果酸脱氢酶在大肠杆菌中的诱导表达 | 第16页 |
| ·粗酶液的制备 | 第16页 |
| ·Ni-NTA纯化粗酶液 | 第16-17页 |
| ·SDS-PAGE | 第17页 |
| ·苹果酸脱氢酶的酶活测定 | 第17页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第17页 |
| ·苹果酸脱氢酶的酶学性质 | 第17-18页 |
| ·苹果酸脱氢酶的分泌表达 | 第18-19页 |
| ·苹果酸脱氢酶热稳定性的定点改造 | 第19-22页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第22-37页 |
| ·大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因的克隆表达、纯化和酶学性质研究 | 第22-27页 |
| ·重组质粒pET-28a-mdh的构建及其结果 | 第22页 |
| ·大肠杆菌苹果酸脱氢酶(MDH)诱导表达及纯化结果 | 第22-23页 |
| ·苹果酸脱氢酶的酶学性质 | 第23-27页 |
| ·大肠杆菌苹果酸脱氢酶分泌表达结果分析 | 第27-29页 |
| ·重组质粒pET-22b-mdh的构建及酶切验证 | 第27页 |
| ·重组菌pET-22b-mdh/BL21的诱导表达及SDS-PAGE分析 | 第27-28页 |
| ·分泌表达的苹果酸脱氢酶比酶活的测定及结果分析 | 第28-29页 |
| ·苹果酸脱氢酶热稳定性的定点改造 | 第29-35页 |
| ·苹果酸脱氢酶基因mdh定点突变的位点 | 第29页 |
| ·重叠延伸PCR的结果分析 | 第29-30页 |
| ·重组质粒pET-28a-mdh(L225K、Q229E、D45E)的构建及酶切验证 | 第30-32页 |
| ·重组质粒pET-28a-mdh(L225K、Q229E、D45E)在大肠杆菌BL21中的诱导表达及SDS-PAGE验证 | 第32-34页 |
| ·定点突变后的苹果酸脱氢酶最适温度的比较结果 | 第34页 |
| ·定点改造后的苹果酸脱氢酶热稳定性比较 | 第34-35页 |
| ·定点突变后苹果酸脱氢酶热稳定性提高位点的氨基酸分析 | 第35页 |
| ·小结 | 第35-37页 |
| 第四章 结论与展望 | 第37-38页 |
| ·结论 | 第37页 |
| ·展望 | 第37-38页 |
| 致谢 | 第38-39页 |
| 参考文献 | 第39-44页 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第44页 |
