| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-8页 |
| 第一章 引言 | 第8-16页 |
| ·甾体药物研究进展 | 第8-10页 |
| ·甾体化合物概述 | 第8页 |
| ·甾体药物概述 | 第8-9页 |
| ·雄甾烯酮概述 | 第9-10页 |
| ·植物甾醇微生物转化合成AD(D)的研究进展 | 第10-12页 |
| ·选择性甾体边链降解技术 | 第10-11页 |
| ·甾醇新型转化体系研究进展 | 第11-12页 |
| ·甾体微生物转化过程中关键酶KSDD研究 | 第12-13页 |
| ·KSDD的性质 | 第12页 |
| ·KSDD研究进展 | 第12-13页 |
| ·本课题立题意义和主要研究任务 | 第13-16页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第16-22页 |
| ·实验材料 | 第16-17页 |
| ·实验仪器 | 第16页 |
| ·菌株与质粒 | 第16页 |
| ·工具酶与试剂 | 第16-17页 |
| ·培养基及培养条件 | 第17页 |
| ·实验方法 | 第17-22页 |
| ·PCR引物 | 第17-18页 |
| ·分枝杆菌染色体DNA的制备 | 第18页 |
| ·PCR反应体系及反应条件 | 第18页 |
| ·PCR产物回收以及与pMD18-T vector连接 | 第18页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第18-19页 |
| ·大肠杆菌热击转化 | 第19页 |
| ·转化子的筛选与鉴定 | 第19页 |
| ·质粒提取步骤 | 第19页 |
| ·大肠杆菌重组表达载体的构建及ksdD基因的诱导表达 | 第19页 |
| ·重组大肠杆菌SDS-PAGE分析 | 第19页 |
| ·分枝杆菌感受态细胞制备 | 第19-20页 |
| ·分枝杆菌电击转化 | 第20页 |
| ·转化子的筛选与鉴定 | 第20页 |
| ·分枝杆菌KSDD酶活测定方法 | 第20-21页 |
| ·产物雄甾烯酮检测方法 | 第21-22页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第22-41页 |
| ·ksdD基因在大肠杆菌中的过量表达及其酶活检测 | 第22-27页 |
| ·分枝杆菌ksdD基因的克隆及核苷酸序列分析 | 第22-23页 |
| ·大肠杆菌重组表达载体pET-28a-ksdD的构建 | 第23-25页 |
| ·ksdD基因在大肠杆菌中表达 | 第25页 |
| ·重组大肠杆菌质粒稳定性分析 | 第25-26页 |
| ·重组大肠杆菌SDS-PAGE分析 | 第26页 |
| ·重组菌3-甾酮-△~1-脱氢酶酶活测定 | 第26页 |
| ·KSDD诱导表达条件优化 | 第26-27页 |
| ·小结 | 第27页 |
| ·ksdD基因敲除及其对菌株AD(D)合成的影响 | 第27-33页 |
| ·ksdD基因敲除载体pMD18-T-ksdD::Km的构建 | 第27-29页 |
| ·以基因元件ksdD::Km电转化分枝杆菌 | 第29页 |
| ·ksdD基因缺失阳性转化子的筛选 | 第29-30页 |
| ·ksdD基因缺失对菌株生长的影响 | 第30-31页 |
| ·M.neoaurum(ksdD::Km)KSDD酶活力测定 | 第31-32页 |
| ·M.neoaurum(ksdD::Km)甾醇转化实验 | 第32页 |
| ·小结 | 第32-33页 |
| ·ksdD基因整合及其对菌株AD(D)合成的影响 | 第33-41页 |
| ·ksdD基因整合载体pETPkan-ksdD-16SrDNA构建 | 第33-36页 |
| ·以线性化的基因元件pETPkan-ksdD-16SrDNA电转化分枝杆菌 | 第36-37页 |
| ·ksdD基因整合阳性转化子筛选 | 第37-38页 |
| ·ksdD基因过量表达对菌株生长的影响 | 第38-39页 |
| ·M.neoaurum(Pkan-ksdD)KSDD酶活力测定 | 第39页 |
| ·M.neoaurum(Pkan-ksdD)甾醇转化实验 | 第39-40页 |
| ·小结 | 第40-41页 |
| 结论与展望 | 第41-43页 |
| 致谢 | 第43-44页 |
| 参考文献 | 第44-49页 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第49页 |
