| 摘要 | 第6-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 缩略词表 | 第13-21页 |
| 第一章 绪论 | 第21-39页 |
| 1 研究目的及意义 | 第21-22页 |
| 2 国内外研究进展 | 第22-37页 |
| 2.1 BVDV的研究进展 | 第22-28页 |
| 2.1.1 BVDV的基因组特征 | 第23-24页 |
| 2.1.2 BVDV的流行病学研究 | 第24-25页 |
| 2.1.3 BVDV引起的先天性免疫耐受和持续性感染 | 第25-27页 |
| 2.1.4 BVDV的防治 | 第27-28页 |
| 2.2 细胞凋亡与病毒感染 | 第28-32页 |
| 2.2.1 细胞凋亡的形态学特征 | 第28-29页 |
| 2.2.2 细胞凋亡的步骤 | 第29-30页 |
| 2.2.3 细胞凋亡的机制 | 第30-31页 |
| 2.2.4 病毒感染诱导细胞凋亡 | 第31-32页 |
| 2.2.5 病毒逃避细胞凋亡 | 第32页 |
| 2.3 长非编码RNA(lncRNA)与病毒感染 | 第32-37页 |
| 2.3.1 lncRNA的分类 | 第32-33页 |
| 2.3.2 lncRNA的功能 | 第33-35页 |
| 2.3.3 lncRNA的作用机制 | 第35页 |
| 2.3.4 lncRNA在病毒感染过程中发挥调控作用 | 第35-37页 |
| 3 研究内容 | 第37-39页 |
| 3.1 不同生物型BVDV感染MDBK细胞的lncRNA和mRNA文库的构建 | 第37页 |
| 3.1.1 测序样品的制备 | 第37页 |
| 3.1.2 RNA样品的质量检测 | 第37页 |
| 3.1.3 高通量测序数据的质量检测 | 第37页 |
| 3.2 BVDV感染MDBK细胞的lncRNA和mRNA的生物信息学分析及差异表达验证 | 第37页 |
| 3.2.1 基于cleanreads的生物信息学分析 | 第37页 |
| 3.2.2 DEGs的qRT-PCR验证 | 第37页 |
| 3.3 凋亡相关lncRNA1620的功能研究 | 第37-38页 |
| 3.3.1 凋亡相关lncRNA1620的筛选 | 第37页 |
| 3.3.2 lncRNA1620在MDBK细胞中的定位 | 第37-38页 |
| 3.3.3 验证lncRNA1620的功能 | 第38页 |
| 3.4 lncRNA1620调控细胞凋亡的分子机制研究 | 第38-39页 |
| 3.4.1 lncRNA1620对靶基因的调控 | 第38页 |
| 3.4.2 lncRNA1620调控靶基因BIRC3的机制 | 第38页 |
| 3.4.3 验证lncRNA1620对靶基因BIRC3的调控 | 第38-39页 |
| 第二章 试验研究 | 第39-133页 |
| 试验一 不同生物型BVDV感染MDBK细胞的lncRNA和mRNA文库的构建 | 第39-54页 |
| 1 材料与方法 | 第39-46页 |
| 1.1 材料 | 第39-40页 |
| 1.1.1 细胞和毒株 | 第39-40页 |
| 1.1.2 实验主要仪器 | 第40页 |
| 1.1.3 实验主要试剂 | 第40页 |
| 1.2 方法 | 第40-46页 |
| 1.2.1 MDBK细胞的准备 | 第40页 |
| 1.2.2 BVDVNADL和BVDVC17病毒株的扩繁 | 第40页 |
| 1.2.3 BVDVNADL病毒TCID50的测定 | 第40-41页 |
| 1.2.4 BVDVNADL和BVDVC17病毒RNA的提取和cDNA的获得 | 第41页 |
| 1.2.5 RT-PCR检测BVDVNADL和BVDVC17病毒5’/UTR的相对表达量 | 第41-42页 |
| 1.2.6 细胞免疫荧光观察BVDV感染MDBK细胞 | 第42页 |
| 1.2.7 BVDV感染MDBK细胞的RNA-seq文库构建 | 第42-45页 |
| 1.2.8 RNA-seq文库测序 | 第45页 |
| 1.2.9 对原始数据进行质量检测 | 第45页 |
| 1.2.10 数据过滤 | 第45-46页 |
| 2 结果与分析 | 第46-51页 |
| 2.1 BVDVNADL的TCID50检测 | 第46页 |
| 2.2 RT-qPCR检测病毒拷贝数 | 第46页 |
| 2.3 细胞免疫荧光检测BVDV感染MDBK细胞 | 第46-47页 |
| 2.4 总RNA样品的质量检测 | 第47-48页 |
| 2.5 原始数据的产出和质量鉴定 | 第48-51页 |
| 3 讨论 | 第51-53页 |
| 3.1 RNA-Seq建库质量控制 | 第51-52页 |
| 3.2 高通量测序的特点 | 第52-53页 |
| 4 小结 | 第53-54页 |
| 试验二 BVDV感染MDBK细胞的lncRNA和mRNA的生物信息学分析及差异表达验证 | 第54-94页 |
| 1 材料与方法 | 第54-59页 |
| 1.1 材料 | 第54-55页 |
| 1.1.1 试验仪器 | 第54-55页 |
| 1.1.2 试验试剂 | 第55页 |
| 1.2 方法 | 第55-59页 |
| 1.2.1 参考基因组比对分析 | 第55页 |
| 1.2.2 基因表达水平分析 | 第55页 |
| 1.2.3 转录本拼接 | 第55页 |
| 1.2.4 mRNA的筛选 | 第55页 |
| 1.2.5 lncRNA的筛选 | 第55-56页 |
| 1.2.6 lncRNA靶基因预测 | 第56页 |
| 1.2.7 差异表达lncRNA和mRNA功能富集分析 | 第56页 |
| 1.2.8 lncRNA和mRNA保守性分析 | 第56页 |
| 1.2.9 lncRNA与mRNA的结构特征比较 | 第56页 |
| 1.2.10 可变剪切分析 | 第56-57页 |
| 1.2.11 RT-qPCR对差异表达的lncRNA和mRNA进行验证 | 第57-59页 |
| 2 结果 | 第59-91页 |
| 2.1 与牛的基因组比对 | 第59-60页 |
| 2.2 整体表达水平分析 | 第60-61页 |
| 2.3 lncRNA的筛选与鉴定 | 第61-63页 |
| 2.4 lncRNA与mRNA的差异表达分析 | 第63-65页 |
| 2.5 差异表达基因的功能富集分析 | 第65-85页 |
| 2.5.1 差异表达mRNA的GO富集分析 | 第65-69页 |
| 2.5.2 差异表达mRNA的KEGG分析 | 第69页 |
| 2.5.3 差异表达lncRNA的cis作用靶基因GO富集分析 | 第69-73页 |
| 2.5.4 差异表达lncRNA的cis作用靶基因KEGG分析 | 第73-75页 |
| 2.5.5 差异表达lncRNA的trans作用靶基因GO富集分析 | 第75-84页 |
| 2.5.6 差异表达lncRNA的trans作用靶基因KEGG分析 | 第84-85页 |
| 2.6 lncRNA与mRNA的基因组特征分析 | 第85-88页 |
| 2.6.1 整体表达水平分析 | 第85-86页 |
| 2.6.2 转录本长度分析 | 第86-87页 |
| 2.6.3 保守性分析 | 第87-88页 |
| 2.7 可变剪切分析 | 第88-89页 |
| 2.8 qRT-PCR验证 | 第89-91页 |
| 3 讨论 | 第91-93页 |
| 3.1 差异表达基因分析 | 第91-92页 |
| 3.2 差异表达基因的功能分析 | 第92-93页 |
| 4 小结 | 第93-94页 |
| 试验三 凋亡相关lncRNA1620的功能研究 | 第94-112页 |
| 1 材料与方法 | 第94-100页 |
| 1.1 材料 | 第94-95页 |
| 1.1.1 细胞和毒株 | 第94页 |
| 1.1.2 试验主要仪器 | 第94-95页 |
| 1.1.3 试验主要试剂 | 第95页 |
| 1.2 方法 | 第95-100页 |
| 1.2.1 根据生物信息学分析结果初步挑选凋亡相关lncRNA | 第95页 |
| 1.2.2 荧光原位杂交检测lncRNA1620在MDBK细胞中的定位 | 第95-96页 |
| 1.2.3 BVDVNADL感染MDBK细胞对lncRNA1620和凋亡相关基因转录水平的影响 | 第96-97页 |
| 1.2.4 干扰lncRNA1620在BVDVNADL感染MDBK细胞过程中对凋亡相关基因转录水平的影响 | 第97-98页 |
| 1.2.5 干扰lncRNA1620在BVDVNADL感染MDBK细胞过程中对病毒复制的影响 | 第98-99页 |
| 1.2.6 流式细胞术检测干扰lncRNA1620在BVDVNADL感染MDBK细胞过程中对细胞凋亡的影响 | 第99页 |
| 1.2.7 干扰lncRNA1620在BVDVNADL感染MDBK细胞过程中对Caspase-3活性的影响 | 第99-100页 |
| 1.2.8 统计学分析 | 第100页 |
| 2 结果 | 第100-110页 |
| 2.1 凋亡相关lncRNA的挑选和生物信息学分析 | 第100-103页 |
| 2.2 荧光原位杂交检测lncRNA1620在MDBK细胞中的定位 | 第103-104页 |
| 2.3 BVDVNADL感染MDBK细胞对lncRNA1620和凋亡相关基因转录水平的影响 | 第104-105页 |
| 2.3.1 BVDV感染MDBK细胞不同时间段对lncRNA1620转录水平的影响 | 第104页 |
| 2.3.2 BVDV感染MDBK细胞不同时间段对Bcl-2和Caspase-3转录水平的影响 | 第104-105页 |
| 2.4 干扰lncRNA1620对凋亡相关基因转录水平的影响 | 第105-106页 |
| 2.4.1 针对lncRNA1620的干扰片段的干扰效率 | 第105页 |
| 2.4.2 干扰lncRNA1620对Bcl-2和Caspase-3转录水平的影响 | 第105-106页 |
| 2.4.3 干扰lncRNA1620在BVDV感染MDBK细胞不同时间段对Bcl-2和Caspase-3转录水平的影响 | 第106页 |
| 2.5 干扰lncRNA1620在BVDVNADL感染MDBK细胞过程中对病毒复制的影响 | 第106-107页 |
| 2.6 干扰lncRNA1620和BVDVNADL感染MDBK细胞对细胞凋亡以及Caspase-3活性的影响 | 第107-110页 |
| 2.6.1 干扰lncRNA1620在BVDV感染MDBK细胞过程中对细胞凋亡的影响 | 第107-109页 |
| 2.6.2 干扰lncRNA1620在BVDV感染MDBK细胞过程中对Caspase-3活性的影响 | 第109-110页 |
| 3 讨论 | 第110-111页 |
| 3.1 lncRNA与病毒复制 | 第110页 |
| 3.2 lncRNA与凋亡 | 第110-111页 |
| 3.3 细胞凋亡的研究方法 | 第111页 |
| 4 小结 | 第111-112页 |
| 试验四 lncRNA1620调控细胞凋亡的分子机制研究 | 第112-133页 |
| 1 材料与方法 | 第112-121页 |
| 1.1 材料 | 第112-113页 |
| 1.1.1 细胞和毒株 | 第112-113页 |
| 1.1.2 实验主要仪器 | 第113页 |
| 1.1.3 实验主要试剂 | 第113页 |
| 1.2 方法 | 第113-121页 |
| 1.2.1 根据生物信息学分析结果预测lncRNA1620的靶基因 | 第113页 |
| 1.2.2 BVDVNADL感染MDBK细胞对BIRC3转录水平的影响 | 第113-114页 |
| 1.2.3 干扰lncRNA1620对靶基因BIRC3转录水平的影响 | 第114页 |
| 1.2.4 干扰lncRNA1620在BVDVNADL感染MDBK细胞过程中对lncRNA 1620和BIRC3转录水平的影响 | 第114页 |
| 1.2.5 Westernblot检测干扰lncRNA1620和BVDVNADL感染MDBK细胞对BIRC3蛋白表达水平的影响 | 第114-115页 |
| 1.2.6 干扰BIRC3对lncRNA1620转录水平的影响 | 第115页 |
| 1.2.7 双荧光素酶报告基因载体构建 | 第115-118页 |
| 1.2.8 双荧光素酶报告基因检测lncRNA1620对靶基因BIRC3启动子活性的影响 | 第118页 |
| 1.2.9 ChIRP-qPCR检测lncRNA1620对BIRC3的转录调控 | 第118-121页 |
| 1.2.10 统计学分析 | 第121页 |
| 2 结果与分析 | 第121-130页 |
| 2.1 生物信息学分析预测lncRNA的靶基因 | 第121-122页 |
| 2.2 BVDVNADL感染MDBK细胞对BIRC3转录水平的影响 | 第122页 |
| 2.3 干扰lncRNA1620对靶基因BIRC3转录水平的影响 | 第122-123页 |
| 2.4 干扰lncRNA1620在BVDVNADL感染MDBK细胞过程中对BIRC3表达的影响 | 第123-124页 |
| 2.4.1 干扰lncRNA1620和BVDVNADL感染MDBK细胞对BIRC3转录水平的影响 | 第123-124页 |
| 2.4.2 干扰lncRNA1620和BVDVNADL感染MDBK细胞对BIRC3蛋白表达水平的影响 | 第124页 |
| 2.5 干扰靶基因BIRC3对lncRNA1620转录水平的影响 | 第124-126页 |
| 2.5.1 高效干扰BIRC3的干扰片段筛选 | 第124-125页 |
| 2.5.2 干扰BIRC3后lncRNA1620的转录 | 第125-126页 |
| 2.6 双荧光素酶报告基因检测lncRNA1620对靶基因BIRC3启动子活性的影响 | 第126-127页 |
| 2.6.1 双荧光素酶报告基因系统载体的构建 | 第126-127页 |
| 2.6.2 lncRNA1620对靶基因BIRC3启动子活性影响 | 第127页 |
| 2.7 ChIRP-qPCR验证lncRNA1620对BIRC3的转录调控 | 第127-130页 |
| 2.7.1 探针的制备 | 第127-128页 |
| 2.7.2 ChIRP-qPCR | 第128-130页 |
| 3 讨论 | 第130-132页 |
| 3.1 lncRNA的cis调控作用 | 第130-131页 |
| 3.2 lncRNA的功能研究 | 第131-132页 |
| 4 小结 | 第132-133页 |
| 全文结论 | 第133-134页 |
| 创新点 | 第134-135页 |
| 参考文献 | 第135-151页 |
| 附录1 | 第151-153页 |
| 致谢 | 第153-154页 |
| 作者简介 | 第154-155页 |
| 附录 | 第155页 |
