| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 缩略词表(Abbreviations) | 第7-12页 |
| 前言 | 第12-13页 |
| 第一篇 文献综述 | 第13-27页 |
| 1.1 kisspeptin功能 | 第13-16页 |
| 1.1.1 kisspeptin简介 | 第13页 |
| 1.1.2 kisspeptin及其受体GPR54 | 第13页 |
| 1.1.3 kisspeptin/GPR54信号通路 | 第13-14页 |
| 1.1.4 kisspeptin定位 | 第14页 |
| 1.1.5 kisspeptin对生殖系统的作用 | 第14-15页 |
| 1.1.6 kisspeptin在雌激素与孕激素之间相互作用 | 第15页 |
| 1.1.7 kisspeptin对卵巢机能影响 | 第15页 |
| 1.1.8 kisspeptin在颗粒细胞中的作用 | 第15-16页 |
| 1.1.9 kisspeptin对繁殖的影响 | 第16页 |
| 1.2 颗粒细胞简介 | 第16-19页 |
| 1.2.1 颗粒细胞功能 | 第16-17页 |
| 1.2.2 颗粒细胞对卵泡发育的影响 | 第17页 |
| 1.2.3 颗粒细胞对卵泡闭锁的影响 | 第17-18页 |
| 1.2.4 激素对颗粒细胞凋亡的影响 | 第18-19页 |
| 1.2.5 颗粒细胞凋亡相关蛋白表达 | 第19页 |
| 1.3 高通量测序概述 | 第19-20页 |
| 1.4 miRNA生物学特征 | 第20-27页 |
| 1.4.1 miRNA合成及作用原理 | 第20-21页 |
| 1.4.2 miRNA作用原理 | 第21-22页 |
| 1.4.3 miRNA转录调控模型 | 第22-24页 |
| 1.4.4 miRNA靶基因预测 | 第24页 |
| 1.4.5 miRNA对卵子影响 | 第24-25页 |
| 1.4.6 miRNA对颗粒细胞影响 | 第25-27页 |
| 第二篇 研究内容 | 第27-96页 |
| 第一章 kisspeptin对牛颗粒细胞凋亡miRNA-mRNA的表达谱分析 | 第27-60页 |
| 1.1 实验材料 | 第27-29页 |
| 1.1.1 主要试剂 | 第27-28页 |
| 1.1.2 主要仪器 | 第28-29页 |
| 1.1.3 试剂配制 | 第29页 |
| 1.2 实验方法 | 第29-42页 |
| 1.2.1 试验动物和样品采集 | 第29-30页 |
| 1.2.2 牛颗粒细胞培养 | 第30页 |
| 1.2.3 台盼蓝操作步骤 | 第30-31页 |
| 1.2.4 孕酮检测 | 第31-32页 |
| 1.2.5 总RNA的提取 | 第32页 |
| 1.2.6 总RNA的质量分析 | 第32页 |
| 1.2.7 miRNA及mRNA的数据来源 | 第32-33页 |
| 1.2.8 转录组测序分析 | 第33-36页 |
| 1.2.9 SmallRNA测序分析 | 第36-42页 |
| 1.3 实验结果 | 第42-57页 |
| 1.3.1 ELISA实验检测结果 | 第42页 |
| 1.3.2 RNA质量 | 第42-44页 |
| 1.3.3 测序数据质量评估 | 第44-45页 |
| 1.3.4 测序数据质量控制 | 第45-46页 |
| 1.3.5 基因表达水平的分析 | 第46-49页 |
| 1.3.6 基因的差异表达分析 | 第49-50页 |
| 1.3.7 候选靶基因GO富集分析 | 第50-52页 |
| 1.3.8 差异基因KEGG富集分析 | 第52-53页 |
| 1.3.9 miRNA-mRNA互作调控网络 | 第53-56页 |
| 1.3.10 荧光定量PCR验证 | 第56-57页 |
| 1.4 讨论 | 第57-59页 |
| 1.5 小结 | 第59-60页 |
| 第二章 kisspeptin促进细胞凋亡的差异miRNA-mRNA靶向关系验证 | 第60-83页 |
| 2.1 实验材料 | 第60-61页 |
| 2.1.1 细胞株、载体质粒 | 第60页 |
| 2.1.2 主要试剂和耗材 | 第60-61页 |
| 2.2 实验方法 | 第61-72页 |
| 2.2.1 细胞复苏 | 第61页 |
| 2.2.2 细胞传代 | 第61-62页 |
| 2.2.3 细胞冻存 | 第62页 |
| 2.2.4 SFRP23’-UTR目的片段设计与合成 | 第62-66页 |
| 2.2.5 SFRP2目的片段与载体连接 | 第66-70页 |
| 2.2.6 psiCHECK-2-mut-SFRP2-3’UTR的构建 | 第70页 |
| 2.2.7 miR-27b调节SFRP2靶基因双荧光素酶活性检测 | 第70-72页 |
| 2.3 实验结果 | 第72-79页 |
| 2.3.1 生物信息学软件预测mRNA与miRNA的结合区域 | 第72页 |
| 2.3.2 SFRP2-3’UTR目的片段退火形成双链图 | 第72-73页 |
| 2.3.3 psiCHECK-2-SFRP2及psiCHECK-2-mut-SFRP2电泳结果示意图 | 第73-74页 |
| 2.3.4 psiCHECK-2重组载体质粒的测序结果 | 第74-75页 |
| 2.3.5 双荧光素酶的活性检测 | 第75-77页 |
| 2.3.6 荧光定量PCR法检测miR-27b与SFRP2靶向关系 | 第77-79页 |
| 2.4 讨论 | 第79-82页 |
| 2.4.1 双荧光素酶报告基因载体选择及构建重组质粒 | 第80-81页 |
| 2.4.2 优化重组载体质粒与miR-27b共转染条件 | 第81页 |
| 2.4.3 miR-27b调控SFRP2的表达 | 第81-82页 |
| 2.5 小结 | 第82-83页 |
| 第三章 kisspeptin通过miR-27b及SFRP2影响牛颗粒细胞凋亡的研究 | 第83-96页 |
| 3.1 实验材料 | 第83-84页 |
| 3.2 实验方法 | 第84-86页 |
| 3.2.1 CCK-8实验测定细胞活力 | 第84页 |
| 3.2.2 miRNA细胞转染 | 第84-85页 |
| 3.2.3 SFRP2siRNA细胞转染 | 第85页 |
| 3.2.4 流式细胞术检测颗粒细胞凋亡 | 第85-86页 |
| 3.3 实验结果 | 第86-94页 |
| 3.3.1 miR-27bmimic对牛颗粒细胞凋亡的影响 | 第86-90页 |
| 3.3.2 SFRP2对牛颗粒细胞凋亡的影响 | 第90-91页 |
| 3.3.3 miR-27b与SFRP2共同作用对牛颗粒细胞凋亡的影响 | 第91-92页 |
| 3.3.4 miR-27b与kp-10共同作用对牛颗粒细胞凋亡的影响 | 第92-94页 |
| 3.4 讨论 | 第94-95页 |
| 3.4.1 miR-27b与牛颗粒细胞凋亡的关系 | 第94-95页 |
| 3.4.2 miR-27b与SFRP2共同作用对牛颗粒细胞凋亡影响 | 第95页 |
| 3.5 小结 | 第95-96页 |
| 结论 | 第96-97页 |
| 参考文献 | 第97-108页 |
| 附录 | 第108-139页 |
| 作者简介 | 第139-140页 |
| 致谢 | 第140页 |
