| 摘要 | 第6-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 第一章 绪论 | 第21-38页 |
| 1.1 双组份信号转导系统概述 | 第21-28页 |
| 1.1.1 双组份信号转导系统的概念 | 第21-23页 |
| 1.1.2 微生物中双组份信号转导系统的多样性 | 第23-24页 |
| 1.1.3 微生物中双组份信号系统的复杂性 | 第24-25页 |
| 1.1.4 微生物中组氨酸激酶的分类 | 第25-28页 |
| 1.2 参与微生物极端环境调控的双组份信号系统 | 第28-34页 |
| 1.2.1 参与渗透压(osmotic stress)胁迫调控的双组份信号系统 | 第28-29页 |
| 1.2.2 参与过氧化压(oxidative stress)胁迫调控的双组份信号系统 | 第29-30页 |
| 1.2.3 参与重金属离子(heavy-metal ion)胁迫调控的双组份信号系统 | 第30-31页 |
| 1.2.4 与盐压(salt stress)胁迫调控的双组份信号系统 | 第31-32页 |
| 1.2.5 低温(cold stress)调控相关的双组份信号系统 | 第32页 |
| 1.2.6 其它极端环境相关的组氨酸激酶 | 第32-34页 |
| 1.3 真菌中双组份信号转导系统的研究现状 | 第34-35页 |
| 1.4 选题依据和技术路线 | 第35-38页 |
| 1.4.1 选题依据 | 第35-36页 |
| 1.4.2 研究背景与意义 | 第36-37页 |
| 1.4.3 技术路线 | 第37-38页 |
| 第二章 红冬孢酵母转录组测序分析 | 第38-49页 |
| 2.1 菌种与材料 | 第38页 |
| 2.2 实验方法 | 第38-39页 |
| 2.2.1 红冬孢酵母YM25235样品处理 | 第38页 |
| 2.2.2 总RNA提取、文库构建以及转录组测序 | 第38页 |
| 2.2.3 转录组测序数据的预处理及De novo拼接 | 第38-39页 |
| 2.2.4 转录本进行功能注释以及代谢途径的分析 | 第39页 |
| 2.3 结果与分析 | 第39-45页 |
| 2.3.1 转录组测序信息及De novo拼接 | 第39-40页 |
| 2.3.2 转录本功能注释解析 | 第40-42页 |
| 2.3.3 15℃条件下红冬孢酵母YM25235基因的差异表达分析 | 第42-43页 |
| 2.3.4 15℃条件下YM25235差异表达基因的代谢途径分析 | 第43-45页 |
| 2.3.5 信号传递途径相关基因表达分析 | 第45页 |
| 2.4 讨论 | 第45-49页 |
| 第三章 红冬孢酵母组氨酸激酶的克隆和序列分析 | 第49-73页 |
| 3.1 材料 | 第49-50页 |
| 3.1.1 菌株和质粒 | 第49页 |
| 3.1.2 主要试剂配方和培养基配方 | 第49-50页 |
| 3.1.3 引物合成和测序 | 第50页 |
| 3.2 方法 | 第50-62页 |
| 3.2.1 红冬孢酵母组氨酸激酶基因HisK2301的克隆及验证 | 第50-55页 |
| 3.2.1.1 红冬孢酵母YM25235总RNA提取 | 第50-52页 |
| 3.2.1.2 对红冬孢酵母YM25235的总RNA进行逆转录 | 第52-53页 |
| 3.2.1.3 组氨酸激酶基因HisK2301的扩增 | 第53页 |
| 3.2.1.4 组氨酸激酶基因HisK2301扩增片段回收 | 第53-54页 |
| 3.2.1.5 组氨酸激酶基因HisK2301回收片段测序验证 | 第54-55页 |
| 3.2.2 组氨酸激酶HisK2301序列分析 | 第55-56页 |
| 3.2.3 组氨酸激酶基因HisK2301mRNA表达水平分析 | 第56-57页 |
| 3.2.3.1 组氨酸激酶基因HisK2301半定量分析 | 第56页 |
| 3.2.3.2 组氨酸激酶基因所实时焚光定量PCR(RT-PCR)分析 | 第56-57页 |
| 3.2.4 组氨酸激酶基因HisK2301与GFP融合质粒构建 | 第57-60页 |
| 3.2.4.1 组氨酸激酶HiK2301片段扩增 | 第57页 |
| 3.2.4.2 组氨酸激酶HiK2301片段回收纯化 | 第57页 |
| 3.2.4.3 质粒pRH2304的提取 | 第57-58页 |
| 3.2.4.4 组氨酸激酶片段与质粒pRH2304的连接与鉴定 | 第58-60页 |
| 3.2.5 重组质粒pRHHisK2301GFP转化红冬孢酵母YM25235 | 第60-61页 |
| 3.2.6 红冬孢酵母YM25235转化子的验证 | 第61-62页 |
| 3.2.6.1 酵母重组转化子预处理 | 第61页 |
| 3.2.6.2 酵母重组转化子基因组DNA的提取 | 第61-62页 |
| 3.2.6.3 酵母重组转化子的验证 | 第62页 |
| 3.2.7 组氨酸激酶与GFP融合蛋白亚细胞定位 | 第62页 |
| 3.3 结果与分析 | 第62-70页 |
| 3.3.1 组氨酸激酶基因HisK2301全长cDNA序列扩增 | 第62-63页 |
| 3.3.2 组氨酸激酶基因HisK2301序列分析 | 第63-67页 |
| 3.3.3 组氨酸激酶HisK2301跨膜区域预测 | 第67页 |
| 3.3.4 组氨酸激酶基因HisK2301mRNA表达水平分析 | 第67-69页 |
| 3.3.5 GFP融合重组质粒pRHHisK2301GFP的构建 | 第69页 |
| 3.3.6 红冬孢酵母YM25235转化子验证 | 第69-70页 |
| 3.3.7 组氨酸激酶在细胞中的定位 | 第70页 |
| 3.4 讨论 | 第70-73页 |
| 第四章 组氨酸激酶HisK2301的功能分析 | 第73-108页 |
| 4.1 材料 | 第73-74页 |
| 4.1.1 菌种与质粒 | 第73页 |
| 4.1.2 主要试剂和培养基 | 第73页 |
| 4.1.3 引物合成和测序 | 第73-74页 |
| 4.2 方法 | 第74-85页 |
| 4.2.1 酿酒酵母诱导型过表达载体pY3HisK2301的构建 | 第74-77页 |
| 4.2.1.1 组氨酸激酶片段的扩增 | 第74-75页 |
| 4.2.1.2 组氨酸激酶片段的回收纯化 | 第75页 |
| 4.2.1.3 质粒pYES3/CT的提取 | 第75页 |
| 4.2.1.4 组氨酸激酶HisK2301片段与质粒pYES3/CT的连接与鉴定 | 第75-77页 |
| 4.2.2 红冬孢酵母组成型重组质粒pRHHisK2301的构建 | 第77-79页 |
| 4.2.2.1 组氨酸激酶HisK2301片段的扩增 | 第77页 |
| 4.2.2.2 组氨酸激酶片段的回收纯化 | 第77页 |
| 4.2.2.3 质粒pRH2304的提取 | 第77页 |
| 4.2.2.4 组氨酸激酶HisK2301片段与质粒pRH2304的连接与鉴定 | 第77-79页 |
| 4.2.3 酵母的转化方法 | 第79页 |
| 4.2.4 红冬孢酵母YM25235重组转化子的检测 | 第79-80页 |
| 4.2.4.1 红冬孢酵母重组转化子基因组DNA的提取 | 第79页 |
| 4.2.4.2 重组转化子的检测 | 第79-80页 |
| 4.2.5 组氨酸激酶与各种环境胁迫的关系 | 第80-82页 |
| 4.2.5.1 转基因酿酒酵母在验证各种环境胁迫前的诱导与培养 | 第80页 |
| 4.2.5.2 红冬孢酵母在验证各种胁迫前的培养 | 第80页 |
| 4.2.5.3 各种胁迫环境对组氨酸激酶的影响 | 第80-82页 |
| 4.2.6 组氨酸激酶LCR结构域功能验证质粒构建 | 第82-85页 |
| 4.2.6.1 组氨酸激酶LCR缺失片段的扩增 | 第82页 |
| 4.2.6.3 组氨酸激酶HisK2301△LCR片段与质粒pYES3/CT的连接与鉴定 | 第82-84页 |
| 4.2.6.4 重组质粒pY3HisK2301△LCR转化酿酒酵母 | 第84页 |
| 4.2.6.5 酿酒酵母转化子验证 | 第84页 |
| 4.2.6.6 组氨酸激酶LCR结构域功能验证 | 第84-85页 |
| 4.3 结果与分析 | 第85-106页 |
| 4.3.1 酿酒酵母重组表达载体pY3HisK2301的构建及转化子验证 | 第85-86页 |
| 4.3.1.1 酿酒酵母重组表达载体pY3HisK2301的构建 | 第85页 |
| 4.3.1.2 酿酒酵母转化子验证 | 第85-86页 |
| 4.3.2 红冬孢酵母重组表达载体pRHHisK2301构建及转化子验证 | 第86-88页 |
| 4.3.2.1 红冬孢酵母重组表达载体pRHHisK2301的构建 | 第86-87页 |
| 4.3.2.2 红冬孢酵母转化子验证 | 第87-88页 |
| 4.3.3 组氨酸激酶HisK2301的环境胁迫抗性分析 | 第88-102页 |
| 4.3.3.1 组氨酸激酶HisK2301的过氧化胁迫抗性分析 | 第88-93页 |
| 4.3.3.2 组氨酸激酶HisK2301的渗透压胁迫抗性分析 | 第93-95页 |
| 4.3.3.3 组氨酸激酶HisK2301的NaCl胁迫抗性分析 | 第95-97页 |
| 4.3.3.4 组氨酸激酶HisK2301的KCl胁迫抗性分析 | 第97-99页 |
| 4.3.3.5 组氨酸激酶HisK2301的重金属离子胁迫抗性分析 | 第99-102页 |
| 4.3.4 组氨酸激酶LCR结构域功能验证 | 第102-104页 |
| 4.3.4.1 组氨酸激酶LCR缺失片段扩增 | 第102页 |
| 4.3.4.2 组氨酸激酶LCR缺失重组质粒构建 | 第102-103页 |
| 4.3.4.3 酿酒酵母转化子验证 | 第103-104页 |
| 4.3.5 组氨酸激酶LCR结构域功能验证 | 第104-106页 |
| 4.3.5.1 组氨酸激酶LCR结构域的渗透压胁迫抗性分析 | 第104-105页 |
| 4.3.5.2 组氨酸激酶LCR结构域与低温胁迫抗性分析 | 第105-106页 |
| 4.4 讨论 | 第106-108页 |
| 第五章 组氨酸激酶与低温合成多不饱和脂肪酸的关系 | 第108-115页 |
| 5.1 实验材料 | 第108页 |
| 5.1.1 菌种与质粒 | 第108页 |
| 5.1.2 主要试剂和培养基配方 | 第108页 |
| 5.1.3 引物序列 | 第108页 |
| 5.2 实验仪器 | 第108页 |
| 5.3 实验方法 | 第108-110页 |
| 5.3.1 转基因红冬孢酵母YM25235菌株的培养与冷处理 | 第108-109页 |
| 5.3.2 提取转基因红冬孢酵母YM25235的不饱和脂肪酸 | 第109-110页 |
| 5.3.3 总RNA的提取和反转录 | 第110页 |
| 5.3.4 △~(12)-脂肪酸脱氢酶定量PCR验证 | 第110页 |
| 5.4 实验结果及分析 | 第110-113页 |
| 5.4.1 组氨酸激酶Hisk2301与红冬孢酵母脂肪酸合成的关系 | 第110-112页 |
| 5.4.2 红冬孢酵母△~(12)-脂肪酸脱氢酶基因mRNA表达水平分析 | 第112-113页 |
| 5.5 讨论 | 第113-115页 |
| 第六章 总结与展望 | 第115-118页 |
| 致谢 | 第118-119页 |
| 参考文献 | 第119-133页 |
| 附录 A 攻读硕士学位期间发表论文 | 第133-134页 |
| 附录 B 实验主要仪器 | 第134-135页 |
| 附录 C 实验常用试剂 | 第135页 |
