| CONTENTS | 第6-10页 |
| 摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-13页 |
| 1 前言 | 第15-23页 |
| 1.1 乳酸菌作为载体疫苗的研究进展 | 第15-16页 |
| 1.1.1 乳酸菌的应用 | 第15-16页 |
| 1.1.2 乳酸菌的肠道黏附作用 | 第16页 |
| 1.1.3 干酪乳杆菌 | 第16页 |
| 1.2 组成型与诱导型表达载体的研究进展 | 第16-17页 |
| 1.3 乳酸菌载体表达元件 | 第17-18页 |
| 1.3.1 乳酸菌表达载体的构成 | 第17页 |
| 1.3.2 本实验中组成型表达盒的构成元件 | 第17-18页 |
| 1.4 翻译增强子的简介及其在表达载体中的应用 | 第18-19页 |
| 1.4.1 转录增强子 | 第18页 |
| 1.4.2 翻译增强子 | 第18-19页 |
| 1.5 产气荚膜梭菌α毒素的研究进展 | 第19页 |
| 1.6 实时荧光定量PCR方法的应用 | 第19-21页 |
| 1.7 流式细胞术在基因表达分析中的应用 | 第21页 |
| 1.8 研究目的及意义 | 第21-23页 |
| 2 材料与方法 | 第23-41页 |
| 2.1 实验材料 | 第23-25页 |
| 2.1.1 质粒与菌种 | 第23页 |
| 2.1.2 抗体制剂 | 第23页 |
| 2.1.3 实验动物 | 第23页 |
| 2.1.4 引物 | 第23-24页 |
| 2.1.5 主要生物学试剂 | 第24页 |
| 2.1.6 培养基 | 第24页 |
| 2.1.7 主要仪器与设备 | 第24-25页 |
| 2.2 试验方法 | 第25-41页 |
| 2.2.1 目的基因的获得 | 第25-29页 |
| 2.2.2 PgsA anchor多克隆抗体的制备 | 第29-31页 |
| 2.2.3 重组干酪乳杆菌表达系统构建 | 第31-34页 |
| 2.2.4 重组干酪乳杆菌PgsA anchor和α毒素融合表达蛋白鉴定 | 第34页 |
| 2.2.5 重组干酪乳杆菌表达载体的优化 | 第34-37页 |
| 2.2.6 优化后重组菌蛋白表达的鉴定及其与优化前重组菌蛋白表达情况的比较分析 | 第37-41页 |
| 3 结果 | 第41-62页 |
| 3.1 目的基因的克隆与序列测定 | 第41-44页 |
| 3.1.1 目的基因的PCR扩增结果 | 第41-42页 |
| 3.1.2 重组质粒的双酶切鉴定结果 | 第42-44页 |
| 3.2 PgsA anchor多克隆抗体的制备 | 第44-47页 |
| 3.2.1 原核表达载体pET-32a-PgsA的构建 | 第44-45页 |
| 3.2.2 PgsA anchor基因在大肠杆菌中表达产物的SDS-PAGE鉴定 | 第45页 |
| 3.2.3 重组蛋白表达鉴定及纯化 | 第45-46页 |
| 3.2.4 间接ELISA检测重组PgsA anchor抗血清效价 | 第46-47页 |
| 3.3 重组干酪乳杆菌表达系统的构建 | 第47-50页 |
| 3.3.1 重组干酪乳杆菌表达载体pPG-PPT与pPG-PPαT的构建图谱 | 第47页 |
| 3.3.2 表达α毒素的重组干酪乳杆菌的构建 | 第47-50页 |
| 3.4 重组干酪乳杆菌PgsA anchor和α毒素融合表达蛋白的鉴定 | 第50-52页 |
| 3.4.1 表达产物的SDS-PAGE鉴定 | 第50页 |
| 3.4.2 表达产物的Western Blot鉴定 | 第50-52页 |
| 3.5 重组干酪乳杆菌表达载体的优化 | 第52-54页 |
| 3.5.1 重组质粒pMD18-TS-T7g10、pMD18-TS-Ω的酶切鉴定 | 第52-53页 |
| 3.5.2 重组菌pPG-T7g10-PPαT/TG1、pPG-Ω-PPαT/TG1的鉴定 | 第53页 |
| 3.5.3 重组干酪乳杆菌pPG-T7g1 0-PPαT/L.casei 393、pPG-Ω-PPαT/L.casei 393 | 第53-54页 |
| 3.6 优化后重组菌蛋白表达的鉴定及其与优化前重组菌蛋白表达情况的比较分析 | 第54-62页 |
| 3.6.1 表达产物的Western Blot鉴定 | 第54页 |
| 3.6.2 表达产物的间接ELISA鉴定 | 第54-56页 |
| 3.6.3 重组菌中mRNA荧光定量PCR相对定量分析 | 第56-58页 |
| 3.6.4 表达产物流式细胞术检测 | 第58-59页 |
| 3.6.5 表达产物的间接免疫荧光定位检测 | 第59-60页 |
| 3.6.6 表达产物的激光共聚焦定位检测 | 第60-62页 |
| 4 讨论 | 第62-66页 |
| 4.1 PgsA anchor与α毒素蛋白融合表达 | 第62-63页 |
| 4.2 T7g10与omega增强子的插入 | 第63页 |
| 4.3 三种重组菌α毒素蛋白表达量ELISA结果比较分析 | 第63页 |
| 4.4 三种重组菌mRNA转录水平比较分析 | 第63-64页 |
| 4.5 重组菌的蛋白表达量流式细胞术结果比较分析 | 第64页 |
| 4.6 重组菌表面表达蛋白的间接免疫荧光与激光共聚焦分析 | 第64页 |
| 4.7 荧光定量PCR方法的应用 | 第64-65页 |
| 4.8 组成型乳酸菌表面表达载体的应用前景 | 第65-66页 |
| 5 结论 | 第66-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-73页 |
| 附录 | 第73-75页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第75页 |
