| 课题资助 | 第4-5页 |
| 符号说明 | 第5-10页 |
| 中文摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-13页 |
| 1 前言 | 第14-25页 |
| 1.1 产气荚膜梭菌及α毒素研究进展 | 第14-19页 |
| 1.1.1 产气荚膜梭菌概述 | 第14-16页 |
| 1.1.2 产气荚膜梭菌病流行情况及影响 | 第16-17页 |
| 1.1.3 α毒素的结构特点与功能 | 第17-19页 |
| 1.2 产气荚膜梭菌α毒素检测方法的研究进展 | 第19-23页 |
| 1.2.1 传统检测α毒素方法 | 第19-21页 |
| 1.2.2 α毒素基因水平上的检测 | 第21-22页 |
| 1.2.3 蛋白质水平上的检测 | 第22-23页 |
| 1.3 研究目的及意义 | 第23-24页 |
| 1.4 本课题的技术路线 | 第24-25页 |
| 2 材料和方法 | 第25-44页 |
| 2.1 材料 | 第25-28页 |
| 2.1.1 实验动物及菌株 | 第25页 |
| 2.1.2 主要试剂及溶液配制 | 第25-27页 |
| 2.1.3 主要试验仪器 | 第27-28页 |
| 2.2 产气荚膜梭菌α毒素的原核表达及纯化 | 第28-32页 |
| 2.2.1 重组α毒素表达质粒的验证 | 第28-29页 |
| 2.2.2 α毒素的原核表达 | 第29-30页 |
| 2.2.3 重组α毒素蛋白的纯化及其含量测定 | 第30-32页 |
| 2.2.4 重组α毒素蛋白的鉴定 | 第32页 |
| 2.3 抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体的制备 | 第32-34页 |
| 2.3.1 实验动物准备 | 第32-33页 |
| 2.3.2 免疫程序 | 第33页 |
| 2.3.3 多克隆抗体的收集及纯化 | 第33-34页 |
| 2.3.4 多克隆抗体效价及纯度的检测 | 第34页 |
| 2.4 抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的制备及特性鉴定 | 第34-40页 |
| 2.4.1 实验小鼠免疫程序 | 第34-35页 |
| 2.4.2 细胞融合 | 第35-36页 |
| 2.4.3 筛选阳性杂交瘤细胞 | 第36-37页 |
| 2.4.4 制备饲养细胞 | 第37页 |
| 2.4.5 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 | 第37-38页 |
| 2.4.6 单克隆抗体腹水制备 | 第38页 |
| 2.4.7 杂交瘤细胞的冻存与复苏 | 第38页 |
| 2.4.8 杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体稳定性测定 | 第38页 |
| 2.4.9 单克隆抗体亚类鉴定 | 第38-39页 |
| 2.4.10 单抗腹水纯化 | 第39页 |
| 2.4.11 单克隆抗体的特性鉴定 | 第39-40页 |
| 2.5 双抗体夹心 ELISA 检测方法的建立 | 第40-42页 |
| 2.5.1 配对抗体的选择及最佳浓度确定 | 第40页 |
| 2.5.2 最佳包被条件的确定 | 第40-41页 |
| 2.5.3 检测抗体最佳作用时间的确定 | 第41页 |
| 2.5.4 封闭条件的确定 | 第41页 |
| 2.5.5 酶标二抗孵育时间及最佳稀释度的确定 | 第41页 |
| 2.5.6 双抗体夹心 ELISA 的基本操作程序 | 第41页 |
| 2.5.7 结果判定标准的确定 | 第41页 |
| 2.5.8 标准曲线的建立 | 第41-42页 |
| 2.5.9 DAS-ELISA 方法性能评价 | 第42页 |
| 2.6 双抗体夹心 ELISA 方法的初步应用 | 第42-44页 |
| 2.6.1 A~E 型产气荚膜梭菌标准菌株培养上清中α毒素含量的检测 | 第42-43页 |
| 2.6.2 与多抗-多抗双夹心 ELISA 方法比较 | 第43页 |
| 2.6.3 与国外双夹心 ELISA 试剂盒检测结果比较 | 第43页 |
| 2.6.4 临床样品检测的初步应用 | 第43-44页 |
| 3 结果和分析 | 第44-56页 |
| 3.1 产气荚膜梭菌α毒素的原核表达及纯化 | 第44-46页 |
| 3.1.1 重组α毒素质粒酶切与测序结果 | 第44页 |
| 3.1.2 α毒素的原核表达 | 第44-45页 |
| 3.1.3 重组α毒素蛋白的纯化 | 第45-46页 |
| 3.1.4 重组α毒素蛋白的鉴定 | 第46页 |
| 3.2 抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体的制备 | 第46-47页 |
| 3.3 抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体的制备及特性鉴定 | 第47-51页 |
| 3.3.1 免疫小鼠抗体效价检测结果 | 第47页 |
| 3.3.2 细胞融合率及亚克隆结果 | 第47-48页 |
| 3.3.3 单抗亚类鉴定结果 | 第48页 |
| 3.3.4 杂交瘤细胞分泌稳定性检测 | 第48页 |
| 3.3.5 腹水纯化及效价检测结果 | 第48-49页 |
| 3.3.6 单克隆抗体的特性鉴定 | 第49-51页 |
| 3.4 双抗体夹心 ELISA 方法的建立 | 第51-54页 |
| 3.4.1 配对抗体的选择及最佳浓度确定 | 第51页 |
| 3.4.2 DAS-ELISA 检测方法最佳反应条件确定 | 第51-52页 |
| 3.4.3 结果判定标准的确定及标准曲线的建立 | 第52-53页 |
| 3.4.4 DAS-ELISA 方法性能评价 | 第53-54页 |
| 3.5 双抗体夹心 ELISA 方法的初步应用 | 第54-56页 |
| 3.5.1 A~E 型产气荚膜梭菌标准菌株培养上清中α毒素含量的检测 | 第54页 |
| 3.5.2 与多抗-多抗双夹心 ELISA 方法比较 | 第54-55页 |
| 3.5.3 与国外双夹心 ELISA 试剂盒检测比较结果 | 第55页 |
| 3.5.4 临床样品检测的初步应用 | 第55-56页 |
| 4 讨论 | 第56-59页 |
| 4.1 原核表达重组α毒素蛋白的重要性 | 第56页 |
| 4.2 抗α毒素多克隆抗体的制备 | 第56-57页 |
| 4.3 抗α毒素单克隆抗体的制备及注意的问题 | 第57页 |
| 4.4 双抗体夹心 ELISA 方法的优势 | 第57-58页 |
| 4.5 双抗体夹心 ELISA 检测方法的初步应用 | 第58-59页 |
| 5 结论 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-68页 |
| 致谢 | 第68-69页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第69页 |
