| 摘要 | 第9-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 缩略语表 | 第15-17页 |
| 1 前言 | 第17-25页 |
| 1.1 立题依据 | 第17-18页 |
| 1.2 T-2 毒素引起生长抑制的研究进展 | 第18-22页 |
| 1.2.1 T-2 毒素引起大脑和肠上皮细胞损伤而导致生长迟缓 | 第18-19页 |
| 1.2.2 T-2 毒素通过抑制蛋白质合成而导致生长抑制 | 第19-20页 |
| 1.2.3 生长激素(GH)可能是T-2 毒素引起生长抑制的一个新的靶标 | 第20页 |
| 1.2.4 炎性因子、转录因子表达异常和相关信号通路激活在T-2 毒素所致的生长阻滞中具有重要作用 | 第20-22页 |
| 1.3 转录因子AKNA的研究进展 | 第22-23页 |
| 1.4 研究内容和目标 | 第23-25页 |
| 1.4.1 研究内容 | 第24页 |
| 1.4.2 研究目标 | 第24-25页 |
| 2 材料方法 | 第25-53页 |
| 2.1 细胞株 | 第25页 |
| 2.2 主要试剂 | 第25-28页 |
| 2.3 主要仪器 | 第28-29页 |
| 2.4 主要试剂配制 | 第29-30页 |
| 2.5 细胞培养及冻存 | 第30-31页 |
| 2.5.1 细胞复苏 | 第30页 |
| 2.5.2 细胞传代 | 第30-31页 |
| 2.5.3 细胞冻存 | 第31页 |
| 2.6 实时荧光定量PCR检测相关基因的mRNA表达 | 第31-34页 |
| 2.6.1 细胞处理及分组 | 第31页 |
| 2.6.2 RNA的提取 | 第31-32页 |
| 2.6.3 RNA质量和纯度的检测 | 第32页 |
| 2.6.4 逆转录为cDNA | 第32-33页 |
| 2.6.5 实时荧光定量PCR | 第33-34页 |
| 2.7 不同抑制剂对AKNA和GH表达的影响 | 第34-36页 |
| 2.8 Western blot方法测定相关蛋白水平及其磷酸化水平 | 第36-39页 |
| 2.8.1 总蛋白提取 | 第36页 |
| 2.8.2 蛋白浓度的测定 | 第36-37页 |
| 2.8.3 SDS-PAGE电泳 | 第37-38页 |
| 2.8.4 Western印迹杂交 | 第38-39页 |
| 2.9 CREB和p65超表达试验 | 第39-43页 |
| 2.9.1 CREB和p65超表达载体的构建 | 第39-42页 |
| 2.9.2 pcDNA3.1-CREB和pcDNA3.1-p65表达载体转染到GH3细胞 | 第42-43页 |
| 2.10 间接免疫荧光双标试验 | 第43-44页 |
| 2.10.1 细胞爬片的制备 | 第43页 |
| 2.10.2 间接免疫荧光 | 第43-44页 |
| 2.11 双荧光素酶报告基因试验 | 第44-46页 |
| 2.11.1 pGL3-AKNA双荧光素酶报告基因载体的构建 | 第44-45页 |
| 2.11.2 pGL3-AKNA转染到GH3细胞 | 第45页 |
| 2.11.3 双荧光素酶活性的检测及分析 | 第45-46页 |
| 2.12 染色质免疫共沉淀结合RT-PCR分析 | 第46-50页 |
| 2.12.1 细胞处理及分组 | 第46页 |
| 2.12.2 GH3细胞的固定交联与样品制备 | 第46页 |
| 2.12.3 细胞核处理和染色质剪切 | 第46-47页 |
| 2.12.4 分析染色质的浓度和酶切情况 | 第47页 |
| 2.12.5 染色质免疫共沉淀 | 第47-48页 |
| 2.12.6 将染色质从抗体/蛋白G磁珠上洗脱并解交联 | 第48页 |
| 2.12.7 离心柱纯化DNA | 第48-49页 |
| 2.12.8 PCR检测分析 | 第49-50页 |
| 2.12.9 qRT-PCR检测分析 | 第50页 |
| 2.13 RNAi技术抑制AKNA基因表达 | 第50-52页 |
| 2.13.1 pSicoR-AKNA干扰载体的构建 | 第50-52页 |
| 2.13.2 pSicoR-AKNA干扰质粒转染到GH3细胞 | 第52页 |
| 2.14 统计学分析 | 第52-53页 |
| 3 结果 | 第53-73页 |
| 3.1 GH3细胞的培养 | 第53页 |
| 3.2 细胞总RNA质量的鉴定 | 第53-54页 |
| 3.3 T-2 毒素与转录因子AKNA之间的量效关系和时效关系 | 第54-55页 |
| 3.4 T-2 毒素对与生长抑制相关基因的影响 | 第55-56页 |
| 3.5 筛选参与调控AKNA及与生长抑制相关的信号通路 | 第56-58页 |
| 3.6 pcDNA3.1-CREB和pcDNA3.1-p65过表达载体的构建及过表达 | 第58-61页 |
| 3.7 T-2 毒素对CREB和p65磷酸化入核过程的影响以及AKNA的亚细胞定位 | 第61-63页 |
| 3.8 AKNA启动子区双荧光素酶报告基因载体的构建 | 第63-64页 |
| 3.9 CREB和p65对转录因子AKNA启动子转录活性的影响 | 第64-65页 |
| 3.10 T-2 毒素对CREB和p65与AKNA启动子结合活性的影响 | 第65-68页 |
| 3.11 转录因子AKNA对GH和炎性细胞因子表达的影响 | 第68-73页 |
| 4 讨论 | 第73-83页 |
| 4.1 转录因子AKNA是T-2 毒素一个新的分子作用靶标 | 第74-78页 |
| 4.1.1 转录因子AKNA参与调控T-2 毒素诱导炎性因子的表达 | 第74-77页 |
| 4.1.2 转录因子AKNA是T-2 毒素诱导GH下调的一个关键调控因子 | 第77-78页 |
| 4.2 PKA/CREB和NF-κB/p65信号通路是调控转录因子AKNA的主要信号通路 | 第78-82页 |
| 4.2.1 CREB和p65通过直接与AKNA启动子结合调控AKNA的表达 | 第78-79页 |
| 4.2.2 转录因子AKNA位于大鼠GH3细胞的细胞质 | 第79-81页 |
| 4.2.3 转录因子AKNA是PKA/CREB、NF-κB信号通路调控炎性因子表达的关键节点 | 第81-82页 |
| 4.3 结论 | 第82-83页 |
| 5 全文创新性总结 | 第83-85页 |
| 6 文献综述 | 第85-95页 |
| 6.1 转录因子AKNA功能调控的研究进展 | 第85-89页 |
| 6.1.1 AKNA的结构特征 | 第85-86页 |
| 6.1.2 AKNA的生物学功能 | 第86-87页 |
| 6.1.3 AKNA的功能调控 | 第87-88页 |
| 6.1.4 转录因子AKNA研究中的问题与展望 | 第88-89页 |
| 6.2 转录因子研究方法进展 | 第89-95页 |
| 6.2.1 转录因子的结构特征 | 第89-91页 |
| 6.2.2 转录因子的研究方法 | 第91-94页 |
| 6.2.3 展望 | 第94-95页 |
| 参考文献 | 第95-113页 |
| 致谢 | 第113-114页 |
| 作者简介 | 第114-115页 |
| 附录 | 第115-120页 |
