| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 缩略语表 | 第7-17页 |
| 第一章 绪论 | 第17-42页 |
| ·真菌资源生物活性蛋白质的研究 | 第17-31页 |
| ·核糖体失活蛋白 | 第18-20页 |
| ·抗真菌蛋白质 | 第20-21页 |
| ·类-泛素蛋白质 | 第21-23页 |
| ·免疫调节蛋白 | 第23-25页 |
| ·漆酶 | 第25-26页 |
| ·凝集素 | 第26-30页 |
| ·抗动植物病毒蛋白 | 第30-31页 |
| ·真菌具生物活性蛋白质基因的结构研究与异源表达 | 第31-36页 |
| ·真菌具生物活性蛋白质基因的分离与结构研究 | 第31-33页 |
| ·真菌具生物活性蛋白质基因的克隆与异源表达 | 第33-35页 |
| ·真菌具有物活性蛋白质表达体系 | 第35-36页 |
| ·大肠杆菌表达体系 | 第35页 |
| ·植物表达体系 | 第35-36页 |
| ·酵母菌表达体系 | 第36页 |
| ·丝状真菌表达体系 | 第36页 |
| ·毛头鬼伞的生物活性物质 | 第36-39页 |
| ·毛头鬼伞的概况 | 第36-37页 |
| ·毛头鬼伞的活性多糖成分 | 第37-38页 |
| ·毛头鬼伞的生物活性蛋白 | 第38-39页 |
| ·毛头鬼伞的其他活性 | 第39页 |
| ·本研究的目的、内容和意义 | 第39-42页 |
| ·本研究的目的 | 第39-40页 |
| ·本研究的内容 | 第40-41页 |
| ·本研究的意义 | 第41-42页 |
| 第二章 抗性蛋白y3基因的DNA全长序列的分离 | 第42-60页 |
| ·实验材料 | 第42-44页 |
| ·实验用菌种 | 第42页 |
| ·载体 | 第42页 |
| ·生物信息软件及网络资源 | 第42页 |
| ·接头和引物 | 第42-43页 |
| ·试剂及试剂盒 | 第43页 |
| ·主要试剂的配制 | 第43-44页 |
| ·培养基 | 第43页 |
| ·真菌基因组DNA提取用试剂 | 第43页 |
| ·细菌质粒DNA提取用试剂 | 第43-44页 |
| ·细菌感受态细胞制备用试剂 | 第44页 |
| ·DNA琼脂糖凝胶电泳 | 第44页 |
| ·实验方法 | 第44-53页 |
| ·菌种的培养和菌丝体的准备 | 第44页 |
| ·基因组DNA的提取 | 第44-45页 |
| ·大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 | 第45-46页 |
| ·菌种的活化和培养 | 第45页 |
| ·感受态的制备 | 第45-46页 |
| ·YADE法分离基因y3DNA全长序列的策略 | 第46-47页 |
| ·用YADE法扩增基因y3 5'-末端和3'-末端 | 第47-49页 |
| ·DNA的酶切 | 第47-48页 |
| ·接头的制备 | 第48页 |
| ·连接 | 第48-49页 |
| ·PCR扩增 | 第49页 |
| ·扩增产物的电泳分离 | 第49-50页 |
| ·琼脂糖凝胶中核酸片段的回收 | 第50页 |
| ·回收片段与T-载体连接 | 第50页 |
| ·大肠杆菌DH5α感受态细胞转化 | 第50-51页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第51-52页 |
| ·重组质粒DNA的双酶切和PCR鉴定 | 第52-53页 |
| ·重组质粒DNA的双酶切鉴定 | 第52页 |
| ·重组质粒DNA的PCR鉴定 | 第52-53页 |
| ·基因分离产物的序列测定 | 第53页 |
| ·抗性蛋白y3基因DNA拟是全长序列的推测与分析 | 第53页 |
| ·结果与分析 | 第53-58页 |
| ·基因组DNA酶切与抗性蛋白基因y3 5'-末端和3'-末端的PCR扩增结果 | 第53-55页 |
| ·抗性蛋白y3基因5'-末端和3'-末端的PCR扩增产物与T-载体的连接 | 第55-56页 |
| ·基因分离产物的序列测定结果 | 第56-57页 |
| ·抗性蛋白y3基因的5'-末端的测序结果 | 第56页 |
| ·抗性蛋白y3基因的3'-末端的测序结果 | 第56-57页 |
| ·抗性蛋白y3基因的DNA拟是全长序列的推测 | 第57-58页 |
| ·讨论与小结 | 第58-60页 |
| ·YADE方法在TMV抗性蛋白y3基因的拟是全长DNA序列扩增中应用 | 第58-59页 |
| ·YADE方法用于分离基因DNA序列的优点 | 第59-60页 |
| 第三章 抗性蛋白y3基因的cDNA全长序列的克隆 | 第60-78页 |
| ·实验材料 | 第60-62页 |
| ·实验用菌种 | 第60页 |
| ·载体 | 第60页 |
| ·生物信息软件及网络资源 | 第60页 |
| ·引物 | 第60-61页 |
| ·试剂及试剂盒 | 第61页 |
| ·主要试剂的配制 | 第61-62页 |
| ·培养基 | 第61-62页 |
| ·真菌总RNA提取用试剂 | 第62页 |
| ·细菌质粒DNA提取用试剂 | 第62页 |
| ·细菌感受态细胞制备用试剂 | 第62页 |
| ·RNA琼脂糖凝胶电泳 | 第62页 |
| ·实验方法 | 第62-72页 |
| ·菌种的培养和菌丝体的准备 | 第62-63页 |
| ·真菌菌丝体总RNA提取及残余DNA的去除 | 第63-64页 |
| ·真菌菌丝体总RNA提取 | 第63-64页 |
| ·真菌总RNA中残余DNA的去除 | 第64页 |
| ·大肠杆菌TOP10感受态细胞的制备 | 第64-65页 |
| ·用5'-RACE分离抗性蛋白y3基因5'-末端序列的策略 | 第65页 |
| ·用5'-RACE分离y3基因5'-末端序列的操作 | 第65-68页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第66页 |
| ·Hybrid RNA的分解 | 第66页 |
| ·单链cDNA环化或形成首尾连接物 | 第66-67页 |
| ·5'-末端未知序列的PCR扩增 | 第67-68页 |
| ·扩增产物的电泳分离、核酸片段的回收、T-载体连接 | 第68页 |
| ·扩增产物的电泳分离 | 第68页 |
| ·琼脂糖凝胶中核酸片段的回收 | 第68页 |
| ·回收片段与pMD18-T载体连接 | 第68页 |
| ·大肠杆菌TOP10感受态细胞转化 | 第68-69页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第69页 |
| ·重组质粒DNA的双酶切和PCR鉴定 | 第69-70页 |
| ·重组质粒DNA的双酶切鉴定 | 第69页 |
| ·重组质粒DNA的PCR鉴定 | 第69-70页 |
| ·基因克隆产物的序列测定 | 第70页 |
| ·克隆抗性蛋白y3基因的cDNA全长序列用引物的设计 | 第70页 |
| ·用RT-PCR扩增抗性蛋白y3基因的cDNA全长序列 | 第70-72页 |
| ·cDNA第一链的合成 | 第70-71页 |
| ·cDNA全长序列的PCR扩增 | 第71-72页 |
| ·扩增产物的电泳分离、胶回收、T-载体连接、转化与检测 | 第72页 |
| ·扩增产物的电泳分离 | 第72页 |
| ·琼脂糖凝胶中核酸片段的回收 | 第72页 |
| ·回收片段与pMD18-T载体连接 | 第72页 |
| ·大肠杆菌TOP10感受态细胞转化 | 第72页 |
| ·质粒DNA的提取 | 第72页 |
| ·重组质粒DNA的双酶切和PCR检测 | 第72页 |
| ·抗性蛋白y3基因拟是cDNA全长序列的测定 | 第72页 |
| ·抗性蛋白y3基因拟是cDNA全长序列的分析 | 第72页 |
| ·结果与分析 | 第72-77页 |
| ·抗性蛋白y3基因5'-RACE的结果 | 第72-74页 |
| ·抗性蛋白基因cDNA全长序列的扩增 | 第74页 |
| ·本研究所得cDNA序列与抗性蛋白Y3的cDNA序列的同源性比较 | 第74-75页 |
| ·出自毛头鬼伞的一条新28S rRNA序列的发现和测序 | 第75-77页 |
| ·讨论与小结 | 第77-78页 |
| ·核酸提取方法 | 第77页 |
| ·关于5'-RACE方法的讨论 | 第77页 |
| ·y3基因全长序列的同源性分析 | 第77页 |
| ·012-019 片段的发现的启示 | 第77-78页 |
| 第四章 抗性蛋白y3基因的结构分析与28S rRNA的同源性探讨 | 第78-90页 |
| ·抗性蛋白y3基因的结构分析 | 第78-81页 |
| ·材料与方法 | 第78页 |
| ·结果与分析 | 第78-81页 |
| ·抗性蛋白基因y3的DNA与cDNA的结构比较分析 | 第78-79页 |
| ·由cDNA序列推导的抗性蛋白Y3的氨基酸序列 | 第79-80页 |
| ·抗性蛋白y3基因的cDNA序列与氨基酸序列比较 | 第80页 |
| ·由cDNA序列推导的的氨基酸序列与先前报导的抗性蛋白Y3序列的比较 | 第80-81页 |
| ·讨论与小结 | 第81页 |
| ·毛头鬼伞中一条新28S rRNA同源性分析 | 第81-90页 |
| ·材料和方法 | 第81-84页 |
| ·生物学分析软件及聚类分析 | 第81-82页 |
| ·聚类分析中参考的真菌核酸序列 | 第82-84页 |
| ·来源于鬼伞属真菌的核酸序列 | 第82-83页 |
| ·来源于非鬼伞属真菌的核酸序列 | 第83-84页 |
| ·结果与分析 | 第84-88页 |
| ·012-019片段在NCBI中的BLAST结果 | 第84页 |
| ·聚类分析结果 | 第84-88页 |
| ·不同基因之间同源序列区域与PCR扩增出现非目的片段之间的关系分析 | 第88页 |
| ·讨论与小结 | 第88-90页 |
| ·关于片段012-019的同源性确定 | 第88-89页 |
| ·关于鬼伞属核糖体RNA(rRNA)的结构探讨 | 第89页 |
| ·关于PCR扩增过程中出现非目的条带的讨论 | 第89-90页 |
| 第五章 抗性蛋白y3基因的植物表达质粒构建及烟草转化 | 第90-108页 |
| ·实验材料 | 第90-93页 |
| ·实验用菌种和植物 | 第90页 |
| ·载体 | 第90页 |
| ·生物信息软件及网络资源 | 第90页 |
| ·引物 | 第90-91页 |
| ·试剂及试剂盒 | 第91页 |
| ·主要试剂的配制 | 第91-93页 |
| ·培养基 | 第91页 |
| ·DNA和RNA提取用试剂 | 第91-92页 |
| ·细菌质粒DNA提取实验所用试剂 | 第92页 |
| ·细菌感受态细胞制备所用试剂 | 第92页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳 | 第92页 |
| ·Northern blot及核酸杂交用试剂 | 第92页 |
| ·常用抗生素 | 第92-93页 |
| ·实验方法 | 第93-102页 |
| ·真菌、植物培养及实验准备 | 第93页 |
| ·真菌培养 | 第93页 |
| ·植物培养 | 第93页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第93页 |
| ·大肠杆菌TOP10感受态细胞的制备 | 第93页 |
| ·农杆菌LBA4404感受态细胞的制备 | 第93页 |
| ·真菌菌丝体总RNA提取及残余DNA的去除 | 第93页 |
| ·用于植物表达质粒构建的y3基因全长cDNA序列的扩增 | 第93-94页 |
| ·扩增产物的电泳分离、胶回收、T-载体连接、转化与检测、序列测定等 | 第94页 |
| ·抗性蛋白y3基因的植物表达质粒的构建 | 第94-97页 |
| ·y3基因植物表达质粒构建的策略 | 第94页 |
| ·y3基因与植物表达载体pBI121的重组 | 第94页 |
| ·pBI121-y3与植物双元表达载体pCAMBIA1301的重组 | 第94-95页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第95-97页 |
| ·用于农杆菌转化的pCAMBIA1301-y3质粒DNA的制备 | 第97页 |
| ·农杆菌感受态细胞冻融法转化 | 第97-98页 |
| ·pCAMBIA1301-y3质粒冻融法转化农杆菌感受态细胞 | 第97-98页 |
| ·由农杆菌细胞中提取重组质粒DNA | 第98页 |
| ·农杆菌重组质粒DNA的PCR及酶切鉴定 | 第98页 |
| ·抗性蛋白y3基因的植物表达质粒叶盘法转化烟草 | 第98页 |
| ·转基因阳性植株的筛选 | 第98-99页 |
| ·转基因阳性植株的PCR筛选 | 第98-99页 |
| ·转基因阳性植株的RT-PCR筛选 | 第99页 |
| ·转基因阳性植株的鉴定 | 第99-102页 |
| ·用Northern Blot鉴定y3基因在转基因烟草中的表达 | 第99-101页 |
| ·用接种TMV的方法鉴定y3基因产物在转基因烟草中的抗病毒活性 | 第101-102页 |
| ·结果与分析 | 第102-108页 |
| ·毛头鬼伞y3基因的克隆及植物表达质粒构建 | 第102-103页 |
| ·毛头鬼伞y3基因转化烟草 | 第103页 |
| ·转基因烟草的筛选 | 第103-104页 |
| ·抗性蛋白y3基因在植物体中表达的的鉴定 | 第104-106页 |
| ·用Northern Blot鉴定y3基因在烟草中的表达 | 第104-105页 |
| ·y3基因表达产物在转基因烟草中的抗病毒活性 | 第105-106页 |
| ·讨论与小结 | 第106-108页 |
| 结论 | 第108-109页 |
| 创新点 | 第109-111页 |
| 参考文献 | 第111-121页 |
| 攻读博士学位期间取得的科研成果 | 第121-122页 |
| 致谢 | 第122-123页 |
