| 摘要 | 第1-3页 |
| Abstract | 第3-7页 |
| 第一章 绪论 | 第7-13页 |
| ·胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的概况 | 第7-8页 |
| ·胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的结构 | 第7页 |
| ·GLP-1 的生理功能 | 第7页 |
| ·GLP-1 的长效性研究进展 | 第7-8页 |
| ·毕赤酵母表达系统 | 第8-11页 |
| ·毕赤酵母 | 第8-9页 |
| ·毕赤酵母常用宿主和载体 | 第9-10页 |
| ·提高目标蛋白在毕赤酵母中产量的研究进展 | 第10-11页 |
| ·立题背景和研究内容 | 第11-13页 |
| ·立题背景 | 第11-12页 |
| ·研究内容 | 第12-13页 |
| 第二章 原位杂交双膜法筛选目标蛋白高产菌的模型的建立 | 第13-19页 |
| ·材料 | 第13-14页 |
| ·仪器和设备 | 第13页 |
| ·主要试剂 | 第13-14页 |
| ·培养基 | 第14页 |
| ·菌株 | 第14页 |
| ·实验方法 | 第14-17页 |
| ·出发菌株GS115/F_2 发酵曲线的测定和形态学表征 | 第14页 |
| ·原位杂交双膜法筛选模型的建立 | 第14-15页 |
| ·毕赤酵母摇床上的诱导培养 | 第15-16页 |
| ·SDS-PAGE 的制作 | 第16-17页 |
| ·结果与讨论 | 第17-18页 |
| ·毕赤酵母生长曲线和形态学特征 | 第17页 |
| ·原位杂交双膜法筛选显色结果 | 第17-18页 |
| ·毕赤酵母GS115/F_2 摇瓶培养的参数测定 | 第18页 |
| ·本章小结 | 第18-19页 |
| 第三章 毕赤酵母双质粒共表达体系的构建 | 第19-31页 |
| ·材料 | 第20页 |
| ·菌株和质粒 | 第20页 |
| ·试剂 | 第20页 |
| ·仪器和设备 | 第20页 |
| ·酶 | 第20页 |
| ·方法 | 第20-26页 |
| ·重组质粒pPIC9K-GGH 提取 | 第20-21页 |
| ·融合蛋白基因GGH 的扩增与回收 | 第21-22页 |
| ·目的基因和T-载体连接及转化 | 第22-23页 |
| ·阳性转化子的PCR 验证 | 第23页 |
| ·目的基因和表达载体pPICZαB 连接 | 第23-24页 |
| ·阳性转化子pPICZαB-GGH 的双酶切验证和测序 | 第24页 |
| ·线性化重组质粒pPICZαB-GGH | 第24-25页 |
| ·毕赤酵母GS115/F_2 感受态的制备及电转化 | 第25页 |
| ·原位杂交双膜法结合高浓度抗生素筛选高产菌 | 第25-26页 |
| ·结果 | 第26-29页 |
| ·表达质粒pPICZαB-GGH 构建流程 | 第26页 |
| ·融合蛋白GGH 的基因扩增 | 第26-27页 |
| ·双酶切验证及pPICZαB-GGH 基因测序 | 第27页 |
| ·抗生素的浓度选择 | 第27-28页 |
| ·原位双膜法结合高抗生素筛选结果 | 第28-29页 |
| ·本章小结 | 第29-31页 |
| 第四章 高产菌株与出发菌株的比较 | 第31-43页 |
| ·材料 | 第31-32页 |
| ·菌株 | 第31页 |
| ·试剂 | 第31-32页 |
| ·仪器和设备 | 第32页 |
| ·方法 | 第32-36页 |
| ·高产菌GS115/F_2 和出发菌株GS115/F_3 摇床诱导培养比较 | 第32页 |
| ·Western blotting 鉴定 | 第32-33页 |
| ·毕赤酵母基因组的提取 | 第33页 |
| ·常规PCR 验证二次重组菌 | 第33-34页 |
| ·定量PCR 检测融合蛋白基因GGH 拷贝数 | 第34-35页 |
| ·不同浓度的甲醇诱导毕赤酵母高产菌GS115/F_3 在5L 发酵罐的分析 | 第35页 |
| ·高产菌GS115/F_3 和出发菌株GS115/F_2 在5 L 罐上的生长及表达 | 第35-36页 |
| ·结果与讨论 | 第36-42页 |
| ·摇瓶比较高产菌株 GS115/F3 和 出发菌株 GS115/F2 的生长曲线和融合蛋白产量 | 第36-37页 |
| ·融合蛋白GGH 的Western blotting 鉴定 | 第37页 |
| ·毕赤酵母基因组的提取 | 第37-38页 |
| ·PCR 验证二次重组菌 | 第38页 |
| ·定量PCR 结果 | 第38-39页 |
| ·不同浓度甲醇诱导毕赤酵母GS115/F_3 的菌体生长密度和蛋白表达水平 | 第39-41页 |
| ·毕赤酵母GS115 | 第41-42页 |
| ·本章小结 | 第42-43页 |
| 第五章 结论与展望 | 第43-45页 |
| ·主要结论 | 第43页 |
| ·存在的问题 | 第43-45页 |
| 致谢 | 第45-47页 |
| 参考文献 | 第47-51页 |
| 附录一： GGH 序列比对结果 | 第51-53页 |
| 附录二：作者在攻读硕士学位期间发表的论文 | 第53-54页 |
