| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 1 绪论 | 第11-30页 |
| ·课题背景 | 第11页 |
| ·菠萝叶纤维资源与利用现状 | 第11-13页 |
| ·菠萝叶纤维的总体概况 | 第11-12页 |
| ·菠萝叶纤维的性能 | 第12页 |
| ·菠萝叶纤维的应用前景 | 第12-13页 |
| ·果胶酶的研究进展 | 第13-19页 |
| ·果胶酶的定义 | 第13页 |
| ·果胶酶的类型及作用机理 | 第13-17页 |
| ·果胶酶的来源 | 第17-18页 |
| ·果胶酶在纺织上的应用 | 第18-19页 |
| ·木聚糖酶的研究进展 | 第19-22页 |
| ·木聚糖酶的定义及分类 | 第19-20页 |
| ·木聚糖酶的作用机理与酶学性质 | 第20-21页 |
| ·木聚糖酶在纺织工业中的应用 | 第21-22页 |
| ·毕赤酵母表达系统研究进展 | 第22-29页 |
| ·毕赤酵母表达载体 | 第23-24页 |
| ·毕赤酵母表达菌株 | 第24-25页 |
| ·外源基因的整合 | 第25页 |
| ·高拷贝转化菌株的筛选 | 第25-26页 |
| ·影响外源基因表达的因素 | 第26-29页 |
| ·外源基因的自身特点 | 第26-27页 |
| ·外源基因的剂量 | 第27-28页 |
| ·发酵系统培养 | 第28页 |
| ·产物稳定性 | 第28-29页 |
| ·本课题研究的主要内容目的和意义 | 第29-30页 |
| ·主要内容 | 第29页 |
| ·木聚糖酶基因的获得与克隆载体的构建 | 第29页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第29页 |
| ·毕赤酵母工程菌的构建 | 第29页 |
| ·摇瓶表达鉴定三种毕赤酵母工程菌表达蛋白情况以及酶活性质分析 | 第29页 |
| ·果胶裂解酶和木聚糖酶双价工程菌在菠萝叶纤维脱胶中的应用 | 第29页 |
| ·目的 | 第29页 |
| ·意义 | 第29-30页 |
| 2 试验材料与方法 | 第30-46页 |
| ·材料与试剂 | 第30-32页 |
| ·菌种和质粒 | 第30页 |
| ·生化试剂(盒) | 第30页 |
| ·主要仪器 | 第30页 |
| ·主要培养基和常用溶液 | 第30-32页 |
| ·绿色木霉培养基 | 第31页 |
| ·LB(Luria-Bertani)培养基 | 第31页 |
| ·酵母培养基母液的配制 | 第31页 |
| ·酵母培养基 | 第31-32页 |
| ·DNA电泳缓冲液(g/L) | 第32页 |
| ·TE缓冲液(pH 8.0) | 第32页 |
| ·SDS-PAGE配胶贮存液 | 第32页 |
| ·DNS的配制 | 第32页 |
| ·方法与步骤 | 第32-46页 |
| ·木聚糖酶基因xyn2的克隆 | 第32-39页 |
| ·绿色木霉的预处理 | 第32-33页 |
| ·引物设计与合成 | 第33页 |
| ·绿色木霉总RNA的提取 | 第33-34页 |
| ·xyn2基因的反转录 | 第34-35页 |
| ·xyn2基因的PCR反应 | 第35页 |
| ·RT-PCR产物的回收 | 第35-36页 |
| ·xyn2基因与pMD19-T simple Vector的连接 | 第36页 |
| ·大肠杆菌DH5a感受态的制备 | 第36页 |
| ·连接产物转化宿主菌E.coli DH5α感受态细胞 | 第36-37页 |
| ·快速菌液PCR初步鉴定 | 第37页 |
| ·重组质粒的提取 | 第37-38页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第38页 |
| ·xyn2基因的测序及序列分析 | 第38-39页 |
| ·pPIC9K-xyn2表达载体的构建与鉴定 | 第39页 |
| ·含xyn2基因的毕赤酵母工程菌的构建 | 第39-42页 |
| ·pPIC9K-xyn2表达载体的线性化 | 第39页 |
| ·毕赤酵母宿主菌感受态细胞的制备 | 第39页 |
| ·线性化表达载体的电击转化 | 第39-40页 |
| ·多拷贝插入重组菌的筛选 | 第40页 |
| ·多拷贝插入重组菌的鉴定 | 第40-41页 |
| ·含xyn2基因的毕赤酵母工程菌的分泌表达 | 第41-42页 |
| ·摇瓶表达 | 第41页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE检测 | 第41-42页 |
| ·含pelC基因毕赤酵母工程菌构建 | 第42页 |
| ·含pelC基因毕赤酵母工程菌分泌表达 | 第42页 |
| ·含xyn2基因和pelC基因双价工程菌的构建 | 第42-43页 |
| ·pPIC9K-xyr2表达载体和pPIC9K-pelC表达载体的线性化 | 第42页 |
| ·毕赤酵母宿主菌感受态细胞的制备 | 第42页 |
| ·线性化表达载体的电击转化 | 第42-43页 |
| ·多拷贝插入双价工程菌的筛选 | 第43页 |
| ·多拷贝插入双价工程菌的鉴定 | 第43页 |
| ·双价工程菌的分泌表达 | 第43页 |
| ·三种工程菌的重组表达酶的活力测定 | 第43-44页 |
| ·待测酶液的制备 | 第43页 |
| ·木聚糖酶酶活力测定 | 第43页 |
| ·果胶裂解酶活力测定 | 第43-44页 |
| ·三种工程菌的重组表达酶的性质分析 | 第44页 |
| ·双价工程菌在菠萝叶纤维脱胶中的应用 | 第44-46页 |
| ·发酵粗酶液的制备 | 第44页 |
| ·脱胶试验步骤 | 第44页 |
| ·单因子试验 | 第44页 |
| ·脱胶多因子试验 | 第44-45页 |
| ·脱胶效果判定 | 第45页 |
| ·多因子正交试验结果的验证 | 第45-46页 |
| 3 结果与分析 | 第46-57页 |
| ·xyn2基因的克隆 | 第46-48页 |
| ·绿色木霉总RNA提取 | 第46页 |
| ·xyn2基因片度的分离 | 第46-47页 |
| ·xyn2基因序列的测定 | 第47-48页 |
| ·pPIC9K-xyn2表达载体的构建与鉴定 | 第48-49页 |
| ·含xyn2基因的毕赤酵母工程菌的构建 | 第49-51页 |
| ·pPIC9K-xyn2重组表达载体的线性化 | 第49-50页 |
| ·线性化pPIC9K-xyn2重组表达载体的电击转化 | 第50页 |
| ·多拷贝插入木聚糖酶基因毕赤酵母工程菌的筛选 | 第50页 |
| ·多拷贝插入木聚糖酶基因毕赤酵母工程菌的PCR鉴定 | 第50页 |
| ·表达产物的SDS-PAGE的检测 | 第50-51页 |
| ·含peIC基因毕赤酵母工程菌构建 | 第51-52页 |
| ·含pelC基因毕赤酵母工程菌分泌表达产物的SDS-PAGE的检测 | 第51-52页 |
| ·双价工程菌的构建 | 第52-54页 |
| ·pPIC9K-xyn2和pPIC9K-pelC重组表达载体的线性化 | 第52页 |
| ·线性化pPIC9K-xyn2和pPIC9K-pelC重组表达载体的电击转化 | 第52页 |
| ·多拷贝插入双价工程菌的筛选 | 第52页 |
| ·多拷贝插入双价工程菌的PCR鉴定 | 第52-53页 |
| ·双价工程菌分泌表达产物的SDS-PAGE的检测 | 第53-54页 |
| ·重组表达酶的活力测定 | 第54-55页 |
| ·P2产果胶裂解酶、X5产木聚糖酶、PX6产果胶裂解酶、木聚糖酶性质分析 | 第55页 |
| ·双价工程菌在菠萝叶纤维脱胶中的应用 | 第55-57页 |
| ·单因子试验分析 | 第55页 |
| ·多因子试验分析 | 第55-57页 |
| ·正交试验结果 | 第55-56页 |
| ·多因子正交试验结果验证分析 | 第56-57页 |
| 4 讨论 | 第57-59页 |
| ·绿色木霉RNA的提取 | 第57页 |
| ·表达载体的线性化 | 第57页 |
| ·电击转化与整合 | 第57-58页 |
| ·表达产物的检测 | 第58-59页 |
| 5 结论 | 第59-60页 |
| ·木聚糖酶基因的获得 | 第59页 |
| ·毕赤酵母重组菌的构建 | 第59页 |
| ·毕赤酵母重组菌的分泌表达 | 第59页 |
| ·毕赤酵母重组菌分泌酶的活力和性质分析 | 第59页 |
| ·双价工程菌在菠萝叶纤维脱胶中的应用 | 第59-60页 |
| 参考文献 | 第60-68页 |
| 附录 | 第68-71页 |
| 附录1. 符号宿略表 | 第68-69页 |
| 附录2. pPIC9K表达载体图谱 | 第69-70页 |
| 附录3. 菠萝叶纤维脱胶前后对照图 | 第70-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
