| 摘要 | 第8-10页 |
| ABSTRACT | 第10-11页 |
| 上篇 文献综述 产酶溶杆菌的研究进展 | 第12-35页 |
| 1 产酶溶杆菌的分类地位 | 第13-14页 |
| 2 产酶溶杆菌的生境及生物学特性 | 第14-15页 |
| 3 产酶溶杆菌对植物病害的生防机理 | 第15-21页 |
| 3.1 胞外酶 | 第15-17页 |
| 3.1.1 几丁质酶 | 第16页 |
| 3.1.2 β-1,3-葡聚糖酶 | 第16页 |
| 3.1.3 α-水解蛋白酶 | 第16页 |
| 3.1.4 纤维素酶 | 第16-17页 |
| 3.2 次级代谢产物 | 第17-20页 |
| 3.2.1 热稳定抗真菌因子HSAF (Heat-Stable Antifungal Factor) | 第17-19页 |
| 3.2.2 WAP-8294A2 | 第19-20页 |
| 3.2.2 诱导寄主抗病性 | 第20页 |
| 3.3 Ⅳ型菌毛 | 第20-21页 |
| 4 产酶溶杆菌调控机理方面的研究进展 | 第21-22页 |
| 4.1 产酶溶杆菌中rpfG的功能研究 | 第21页 |
| 4.2 产酶溶杆菌中lenB2的功能研究 | 第21页 |
| 4.3 产酶溶杆菌中hfq的功能研究 | 第21页 |
| 4.4 产酶溶杆菌中chpA的功能研究 | 第21-22页 |
| 4.5 产酶溶杆菌中pilR的功能研究 | 第22页 |
| 5 细菌的群体感应系统(Quorum Sensing System) | 第22-27页 |
| 5.1 群体感应系统的主要类型 | 第22-23页 |
| 5.2 依赖DF的群体感应系统 | 第23-27页 |
| 5.2.1 DF群体感应信号分子的发现 | 第23-24页 |
| 5.2.2 DF群体感应信号分子的结构 | 第24-25页 |
| 5.2.3 DF群体感应信号分子参与调控的生物学功能 | 第25-27页 |
| 6 莽草酸途径概述 | 第27-28页 |
| 7 MarR家族蛋白概述 | 第28-31页 |
| 8 LysR家族蛋白概述 | 第31-32页 |
| 9 本文的研究目的及意义 | 第32-35页 |
| 9.1 本文的研究目的 | 第32-33页 |
| 9.2 本文的研究意义 | 第33-35页 |
| 下篇 研究内容 | 第35-115页 |
| 第一章 产酶溶杆菌莽草酸途径调控HSAF的机制研究 | 第37-61页 |
| 1 材料与方法 | 第38-51页 |
| 1.1 材料 | 第38-40页 |
| 1.1.1 供试菌株、质粒和引物 | 第38-39页 |
| 1.1.2 培养基和抗生素 | 第39-40页 |
| 1.1.3 酶、化学试剂和试剂盒 | 第40页 |
| 1.1.4 软件 | 第40页 |
| 1.2 实验方法 | 第40-51页 |
| 1.2.1 blast分析 | 第40-41页 |
| 1.2.2 引物设计 | 第41页 |
| 1.2.3 产酶溶杆菌OH11基因组DNA的提取 | 第41页 |
| 1.2.4 目的片段PCR扩增 | 第41-42页 |
| 1.2.5 PCR产物clean up回收 | 第42-43页 |
| 1.2.6 质粒提取 | 第43页 |
| 1.2.7 目标基因及质粒酶切、回收 | 第43-44页 |
| 1.2.8 连接 | 第44页 |
| 1.2.9 质粒的转化 | 第44-46页 |
| 1.2.10 缺失突变体的构建 | 第46-49页 |
| 1.2.11 黄色素的提取与检测 | 第49-50页 |
| 1.2.12 DF的提取及HPLC检测 | 第50页 |
| 1.2.13 次生代谢产物HSAF的提取及HPLC检测 | 第50-51页 |
| 1.2.14 数据处理 | 第51页 |
| 2 结果分析 | 第51-58页 |
| 2.1 L.enzymobacter OH11中莽草酸关键基因的预测及功能分析 | 第51-52页 |
| 2.2 aroA缺失突变体的构建 | 第52-54页 |
| 2.2.1 aroA基因的克隆 | 第52页 |
| 2.2.2 重组载体的构建和验证 | 第52-53页 |
| 2.2.3 aroA缺失突变体的验证 | 第53-54页 |
| 2.3 互补菌株的构建 | 第54页 |
| 2.4 突变体和互补菌株的RT-PCR验证 | 第54-55页 |
| 2.5 莽草酸途径参与黄色素的生物合成 | 第55-56页 |
| 2.6 莽草酸途径参与DF的生物合成 | 第56-58页 |
| 2.6.1 产酶溶杆菌OH11能够产生DF (3-HBA、4-HBA) | 第56-57页 |
| 2.6.2 莽草酸途径参与DF (3-HBA、4-HBA)的生物合成 | 第57-58页 |
| 2.7 莽草酸途径参与HSAF的生物合成 | 第58页 |
| 3 讨论 | 第58-61页 |
| 第二章 产酶溶杆菌中DF的功能研究 | 第61-79页 |
| 1 材料与方法 | 第62-68页 |
| 1.1 材料 | 第62-64页 |
| 1.1.1 供试菌株、质粒和引物 | 第62-64页 |
| 1.1.2 DF类似物 | 第64页 |
| 1.2 方法 | 第64-68页 |
| 1.2.1 LenB2与XanB2的同源比对 | 第64页 |
| 1.2.2 引物设计 | 第64页 |
| 1.2.3 目的片段PCR扩增 | 第64页 |
| 1.2.4 PCR产物clean up回收 | 第64页 |
| 1.2.5 质粒提取 | 第64页 |
| 1.2.6 目的基因及质粒的酶切、回收 | 第64页 |
| 1.2.7 连接 | 第64页 |
| 1.2.8 转化 | 第64页 |
| 1.2.9 △lenB2△aroA缺失突变体的构建 | 第64-65页 |
| 1.2.10 DF的提取与检测 | 第65页 |
| 1.2.11 HSAF的提取与检测 | 第65页 |
| 1.2.12 蛋白表达与纯化 | 第65-67页 |
| 1.2.13 酶学实验 | 第67页 |
| 1.2.14 系列突变体添加DF及其类似物实验 | 第67页 |
| 1.2.15 生长曲线测定 | 第67页 |
| 1.2.16 lenB2同源基因异源表达 | 第67-68页 |
| 2 结果分析 | 第68-77页 |
| 2.1 LenB2在产酶溶杆菌OH11内保守存在 | 第68页 |
| 2.2 双突变株△lenB2△aroA的构建 | 第68页 |
| 2.3 异源互补菌株的构建 | 第68-69页 |
| 2.4 lenB2是DF产生的关键基因 | 第69-73页 |
| 2.4.1 lenB2是DF产生关键基因的体内证据 | 第69-70页 |
| 2.4.2 lenB2是DF产生关键基因的体外证据 | 第70-73页 |
| 2.5 4-HBA恢复相关突变体HSAF的产量 | 第73-75页 |
| 2.6 aroA基因的缺失不影响生长 | 第75-76页 |
| 2.7 LenB2及其同系物的进化分析 | 第76页 |
| 2.9 异源基因的引入对△lenB2的影响 | 第76-77页 |
| 3 讨论 | 第77-79页 |
| 第三章 产酶溶杆菌中4-HBA的潜在受体LysR_(Le)的功能研究 | 第79-89页 |
| 1 材料与方法 | 第80-83页 |
| 1.1 材料 | 第80-81页 |
| 1.1.1 供试菌株、质粒和引物 | 第80-81页 |
| 1.2 方法 | 第81-83页 |
| 1.2.1 AaeR的同源比对 | 第81页 |
| 1.2.2 引物设计 | 第81页 |
| 1.2.3 目的片段PCR扩增 | 第81页 |
| 1.2.4 PCR产物clean up回收 | 第81页 |
| 1.2.5 质粒提取 | 第81页 |
| 1.2.6 目的基因及质粒的酶切、回收 | 第81页 |
| 1.2.7 连接 | 第81页 |
| 1.2.8 转化 | 第81页 |
| 1.2.9 缺失突变体构建 | 第81-82页 |
| 1.2.10 启动子活性检测 | 第82页 |
| 1.2.11 HSAF的提取与检测 | 第82页 |
| 1.2.12 蛋白的表达与纯化 | 第82页 |
| 1.2.13 凝胶阻滞实验(EMSA) | 第82页 |
| 1.2.14 微量热涌动(MST) | 第82页 |
| 1.2.15 等温滴定量热(ITC) | 第82-83页 |
| 2 结果分析 | 第83-87页 |
| 2.1 LysR_(Le)在产酶溶杆菌OH11内保守存在 | 第83页 |
| 2.2 双突变体△lenB2△lysR_(Le)的构建 | 第83-84页 |
| 2.3 4-HBA 参与HSAF 生物合成依赖于LysR_(Le) | 第84-85页 |
| 2.4 4-HBA 增强LysR_(Le)结合HSAF合成关键基因启动子结合能力 | 第85-86页 |
| 2.5 4-HBA 能够直接结合LysR_(Le) | 第86-87页 |
| 3 讨论 | 第87-89页 |
| 第四章 LenB2下游转录因子MarR_(Le)调控HSAF机制解析 | 第89-115页 |
| 第一节 鉴定DF下游调控HSAF合成的因子 | 第91-103页 |
| 1 材料与方法 | 第91-95页 |
| 1.1 材料 | 第91-93页 |
| 1.2 方法 | 第93-95页 |
| 1.2.1 引物设计 | 第93页 |
| 1.2.2 目的片段PCR扩增 | 第93页 |
| 1.2.3 PCR产物clean up回收 | 第93-94页 |
| 1.2.4 质粒提取 | 第94页 |
| 1.2.5 目的基因及质粒的酶切、回收 | 第94页 |
| 1.2.6 连接 | 第94页 |
| 1.2.7 转化 | 第94页 |
| 1.2.8 缺失突变体的构建 | 第94页 |
| 1.2.9 构建系统发育进化树 | 第94页 |
| 1.2.10 启动子活性检测 | 第94页 |
| 1.2.11 荧光定量PCR | 第94-95页 |
| 1.2.12 HSAF的提取与检测 | 第95页 |
| 1.2.13 微量热涌动(MST) | 第95页 |
| 2 结果分析 | 第95-102页 |
| 2.1 基因芯片分析 | 第95-96页 |
| 2.2 q-RT验证 | 第96页 |
| 2.3 DF调控的3个因子的鉴定及敲除 | 第96-98页 |
| 2.4 marR_(Le)在基因组中的位置及进化分析 | 第98页 |
| 2.5 LenB2/DF负向调控marR_(Le)的转录 | 第98-99页 |
| 2.6 上位遗传分析证实marR_(Le)位于lenB2下游 | 第99-101页 |
| 2.7 MST证实MarR_(Le)不结合DF | 第101-102页 |
| 3 讨论 | 第102-103页 |
| 第二节 MarR_(Le)调控HSAF生物合成的分子机理 | 第103-109页 |
| 1 材料与方法 | 第103-105页 |
| 1.1 材料 | 第103-104页 |
| 1.2 方法 | 第104-105页 |
| 1.2.1 蛋白表达与纯化 | 第104页 |
| 1.2.2 凝胶阻滞实验(EMSA) | 第104页 |
| 1.2.3 微量热涌动(MST) | 第104页 |
| 1.2.4 细菌单杂交 | 第104页 |
| 1.2.5 细菌双杂交 | 第104-105页 |
| 2 结果分析 | 第105-107页 |
| 2.1 生物信息学分析lafB启动子区存在MarR_(Le)结合位点 | 第105-106页 |
| 2.2 细菌单杂交验证MarR_(Le)结合lafB启动子 | 第106页 |
| 2.3 MST验证MarRu结合 lafB启动子 | 第106-107页 |
| 2.4 EMSA验证MarR_(Le)结合 lafB启动子 | 第107页 |
| 2.5 细菌双杂交证实MarR_(Le)与LysR_(Le)不存在相互作用 | 第107页 |
| 3 讨论 | 第107-109页 |
| 第三节 LysR_(Le)调控marR_(Le)转录的分子机理 | 第109-115页 |
| 1 材料与方法 | 第109-110页 |
| 1.1 材料 | 第109-110页 |
| 1.2 方法 | 第110页 |
| 1.2.1 荧光定量PCR | 第110页 |
| 1.2.2 细菌单杂交 | 第110页 |
| 1.2.3 凝胶阻滞实验(EMSA) | 第110页 |
| 2 结果分析 | 第110-113页 |
| 2.1 生物信息学分析 marR_(Le)启动子区存在LysR_(Le)结合位点 | 第110-111页 |
| 2.2 细菌单杂交验证LysR_(Le)结合marR_(Le)启动子 | 第111页 |
| 2.3 EMSA验证LysR_(Le)结合marR_(Le)启动子 | 第111-112页 |
| 2.4 LysR_(Le)正向调控marR_(Le)的表达,并且其正向调控作用小于4-HBA的负向调控作用 | 第112页 |
| 2.5 4-HBA不影响LysR_(Le)结合marR_(Le)启动子 | 第112-113页 |
| 3 讨论 | 第113-115页 |
| 全文总结 | 第115-117页 |
| 本论文创新点 | 第117页 |
| 下一步展望 | 第117-119页 |
| 参考文献 | 第119-131页 |
| 附录 | 第131-137页 |
| 1 缩略语 | 第131页 |
| 2 培养基配制 | 第131-132页 |
| 3 试剂及溶液配制 | 第132-134页 |
| 4 附图 | 第134-137页 |
| 致谢 | 第137-139页 |
| 攻读博士期间发表的论文 | 第139页 |
