| 中文摘要 | 第12-14页 |
| Abstract | 第14-15页 |
| 1 引言 | 第16-30页 |
| 1.1 黄瓜绿斑驳病毒(CGMMV)研究进展 | 第16-19页 |
| 1.1.1 分布和寄主范围 | 第16页 |
| 1.1.2 症状与危害 | 第16-17页 |
| 1.1.3 传播途径 | 第17-18页 |
| 1.1.3.1 种子传播 | 第17-18页 |
| 1.1.3.2 嫁接传播 | 第18页 |
| 1.1.3.3 媒介传播 | 第18页 |
| 1.1.3.4 其他传播途径 | 第18页 |
| 1.1.4 病毒粒子特征和基因组结构 | 第18-19页 |
| 1.2 CGMMV的检测方法 | 第19-21页 |
| 1.2.1 生物学方法 | 第19页 |
| 1.2.2 血清学方法 | 第19-20页 |
| 1.2.3 电子显微镜观察法 | 第20-21页 |
| 1.2.4 分子生物学方法 | 第21页 |
| 1.3 CGMMV的防治 | 第21-28页 |
| 1.3.1 一般性防治策略 | 第21-22页 |
| 1.3.1.1 检验检疫 | 第21页 |
| 1.3.1.2 农业防治 | 第21-22页 |
| 1.3.1.3 化学防治 | 第22页 |
| 1.3.2 交叉保护防治策略 | 第22-27页 |
| 1.3.2.1 交叉保护机制 | 第22-23页 |
| 1.3.2.1.1 衣壳蛋白介导的交叉保护作用 | 第22页 |
| 1.3.2.1.2 RNA介导的交叉保护作用 | 第22-23页 |
| 1.3.2.1.3 交叉保护是病毒的超侵染现象 | 第23页 |
| 1.3.2.2 植物病毒侵染性克隆 | 第23-26页 |
| 1.3.2.2.1 侵染性克隆的类型 | 第24页 |
| 1.3.2.2.2 侵染性克隆的接种方式 | 第24页 |
| 1.3.2.2.3 保证克隆侵染性的方法 | 第24-25页 |
| 1.3.2.2.4 侵染性克隆的应用 | 第25-26页 |
| 1.3.2.3 弱毒株系的获得 | 第26页 |
| 1.3.2.4 交叉保护的应用 | 第26-27页 |
| 1.3.2.5 交叉保护的风险和解决方法 | 第27页 |
| 1.3.3 寻找植物中抗病毒靶标 | 第27-28页 |
| 1.3.3.1 病毒衣壳蛋白的互作蛋白 | 第27页 |
| 1.3.3.2 病毒移动蛋白的互作蛋白 | 第27-28页 |
| 1.3.3.3 病毒复制酶的互作蛋白 | 第28页 |
| 1.4 植物蛋白酶抑制剂 | 第28-29页 |
| 1.4.1 植物蛋白酶抑制剂的分类 | 第28页 |
| 1.4.2 植物蛋白酶抑制剂的功能 | 第28-29页 |
| 1.5 本研究的目的和意义 | 第29-30页 |
| 2 材料与方法 | 第30-47页 |
| 2.1 材料 | 第30-31页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第30页 |
| 2.1.2 菌株与质粒材料 | 第30页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第30-31页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第31页 |
| 2.2 方法 | 第31-47页 |
| 2.2.1 载体构建 | 第31-32页 |
| 2.2.1.1 原核表达载体构建 | 第31页 |
| 2.2.1.2 Pulldown实验载体构建 | 第31页 |
| 2.2.1.3 互作实验载体构建 | 第31-32页 |
| 2.2.1.4 VIGS载体构建 | 第32页 |
| 2.2.2 抗血清的制备 | 第32页 |
| 2.2.3 CGMMV侵染性克隆的构建 | 第32-35页 |
| 2.2.3.1 病毒粒子的提纯及电镜观察 | 第33页 |
| 2.2.3.2 病毒粒子中提取病毒RNA | 第33-34页 |
| 2.2.3.3 植株总RNA的提取 | 第34页 |
| 2.2.3.4 反转录 | 第34-35页 |
| 2.2.3.5 PCR扩增 | 第35页 |
| 2.2.3.6 胶回收 | 第35页 |
| 2.2.4 CGMMV弱毒突变体的构建 | 第35-39页 |
| 2.2.4.1 突变PCR | 第36页 |
| 2.2.4.2 大肠杆菌转化 | 第36-37页 |
| 2.2.4.2.1 大肠杆菌感受态的制备 | 第36-37页 |
| 2.2.4.2.2 大肠杆菌转化 | 第37页 |
| 2.2.4.3 质粒提取 | 第37-38页 |
| 2.2.4.4 突变质粒的鉴定 | 第38页 |
| 2.2.4.5 农杆菌转化 | 第38-39页 |
| 2.2.4.5.1 农杆菌感受态的制备 | 第38页 |
| 2.2.4.5.2 农杆菌转化 | 第38-39页 |
| 2.2.5 交叉保护实验 | 第39-43页 |
| 2.2.5.1 病毒的接种 | 第39页 |
| 2.2.5.1.1 农杆菌浸润 | 第39页 |
| 2.2.5.1.2 摩擦接种 | 第39页 |
| 2.2.5.2 实时荧光定量PCR | 第39-41页 |
| 2.2.5.2.1 引物设计 | 第39-40页 |
| 2.2.5.2.2 实时荧光定量PCR | 第40页 |
| 2.2.5.2.3 基因相对表达量的计算 | 第40-41页 |
| 2.2.5.3 ELISA分析 | 第41-42页 |
| 2.2.5.3.1 溶液配置 | 第41页 |
| 2.2.5.3.2 间接ELISA检测病毒积累 | 第41-42页 |
| 2.2.5.4 Westernblot分析 | 第42-43页 |
| 2.2.5.4.1 溶液配制 | 第42页 |
| 2.2.5.4.2 Westernblot检测病毒积累 | 第42-43页 |
| 2.2.6 互作蛋白的筛选与验证 | 第43-46页 |
| 2.2.6.1 植物蛋白复合体纯化 | 第43页 |
| 2.2.6.2 质谱分析 | 第43-44页 |
| 2.2.6.3 酵母双杂交实验 | 第44-45页 |
| 2.2.6.3.1 试剂配置 | 第44页 |
| 2.2.6.3.2 酵母感受态制备 | 第44-45页 |
| 2.2.6.3.3 酵母双杂交实验 | 第45页 |
| 2.2.6.4 双分子荧光互补实验 | 第45-46页 |
| 2.2.7 病毒诱导的基因沉默 | 第46-47页 |
| 2.2.7.1 实验设计 | 第46页 |
| 2.2.7.2 半定量PCR | 第46-47页 |
| 3 结果与分析 | 第47-75页 |
| 3.1 CGMMV衣壳蛋白抗血清的制备与效价检测 | 第47-49页 |
| 3.1.1 抗血清的制备 | 第47-48页 |
| 3.1.2 抗血清特异性与效价检测 | 第48-49页 |
| 3.2 CGMMV弱毒突变体在本氏烟上的交叉保护作用 | 第49-53页 |
| 3.2.1 突变体的获得 | 第49-50页 |
| 3.2.2 弱毒突变体的筛选 | 第50-51页 |
| 3.2.3 弱毒突变体在本氏烟上的交叉保护效果 | 第51-53页 |
| 3.3 CGMMV弱毒突变体在葫芦科作物上的交叉保护效果 | 第53-60页 |
| 3.3.1 侵染性克隆的构建 | 第53-56页 |
| 3.3.2 弱毒突变体在西瓜上的交叉保护效果 | 第56-60页 |
| 3.4 CGMMVCP互作因子NbPI的确定 | 第60-67页 |
| 3.4.1 CGMMVCP在本氏烟中互作蛋白的筛选 | 第60-61页 |
| 3.4.2 TVBMVCP与NbPI的互作 | 第61-63页 |
| 3.4.3 互作的验证 | 第63-67页 |
| 3.4.3.1 体外互作验证 | 第63-64页 |
| 3.4.3.2 体内互作验证 | 第64-67页 |
| 3.5 NbPI在病毒侵染过程中的作用 | 第67-75页 |
| 3.5.1 沉默NbPI增加CGMMV的积累水平 | 第67-71页 |
| 3.5.2 沉默NbPI增加TVBMV的积累水平 | 第71-75页 |
| 4 讨论 | 第75-80页 |
| 4.1 CGMMVCP抗血清 | 第75页 |
| 4.2 CGMMV侵染性克隆寄主范围的差异 | 第75-76页 |
| 4.3 内含子在侵染性克隆中的重要作用 | 第76页 |
| 4.4 CGMMV弱毒突变体的筛选和交叉保护作用 | 第76-77页 |
| 4.5 病毒蛋白与寄主因子间的相互作用 | 第77-78页 |
| 4.6 植物蛋白酶抑制剂在病毒侵染时的功能 | 第78-80页 |
| 5 结论 | 第80-81页 |
| 参考文献 | 第81-94页 |
| 附录 | 第94-96页 |
| 致谢 | 第96-97页 |
| 攻读博士学位期间发表论文 | 第97页 |
