| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 1. 绪论 | 第13-26页 |
| 1.1 CRISPR-Cas系统 | 第13-22页 |
| 1.1.1 CRISPR-Cas系统作为细菌的免疫系统 | 第13-15页 |
| 1.1.2 CRISPR-Cas系统的三个主要类型 | 第15-16页 |
| 1.1.3 CRISPR-Cas系统的三个主要类型作用机制的异同及Cas蛋白的多样性 | 第16-17页 |
| 1.1.4 CRISPR-Cas9系统作为新型的基因编辑技术的基本原理 | 第17-18页 |
| 1.1.5 CRISPR-Cas9系统作为新型的基因编辑技术的多方面优化 | 第18-19页 |
| 1.1.6 CRISPR-Cas9系统的应用 | 第19-21页 |
| 1.1.7 CRISPR-Cas9系统的发展优势以及潜在问题 | 第21-22页 |
| 1.2 植物生育酚的合成 | 第22-25页 |
| 1.2.1 基本合成途径 | 第23-24页 |
| 1.2.2 关键基因HPT、HGGT | 第24-25页 |
| 1.3 研究内容及意义 | 第25-26页 |
| 2. 实验材料与方法 | 第26-40页 |
| 2.1 实验材料 | 第26页 |
| 2.2 试剂及仪器 | 第26-27页 |
| 2.3 原始载体 | 第27页 |
| 2.4 载体的构建 | 第27-31页 |
| 2.4.1 sgRNA的设计 | 第27-28页 |
| 2.4.2 单个20 bp sgRNA双链的合成 | 第28-29页 |
| 2.4.3 单个sgRNA与pRGE32载体连接 | 第29页 |
| 2.4.4 PTG体系载体构建 | 第29-31页 |
| 2.4.5 sgRNAs串联片段与pRGE32载体连接 | 第31页 |
| 2.5 大肠杆菌转化(热击法) | 第31-32页 |
| 2.6 大肠杆菌中质粒的提取 | 第32-33页 |
| 2.7 植株培养 | 第33页 |
| 2.8 原生质体的提取及转化 | 第33-34页 |
| 2.8.1 原生质体的提取 | 第33-34页 |
| 2.8.2 转化 | 第34页 |
| 2.9 显微镜观察 | 第34-35页 |
| 2.10 植物基因组DNA提取 | 第35页 |
| 2.11 Western Blot | 第35-37页 |
| 2.11.1 SDS-PAGE电泳 | 第35-36页 |
| 2.11.2 转膜 | 第36页 |
| 2.11.3 封闭 | 第36-37页 |
| 2.11.4 显影 | 第37页 |
| 2.12 突变体检测方法 | 第37-38页 |
| 2.12.1 RE-PCR和PCR-RE法 | 第37-38页 |
| 2.12.2 T载体测序 | 第38页 |
| 2.13 RE-qPCR | 第38-40页 |
| 3. 实验结果 | 第40-50页 |
| 3.1 原生质体转化效率 | 第40页 |
| 3.2 Cas9蛋白在大麦原生质体中表达水平的检测 | 第40-41页 |
| 3.3 序列查找与靶位点选择 | 第41-43页 |
| 3.4 构建CRISPR/Cas系统载体 | 第43-46页 |
| 3.5 两种方法检测突变体结果 | 第46-48页 |
| 3.5.1 PCR-RE方法 | 第46-47页 |
| 3.5.2 RE-PCR方法 | 第47-48页 |
| 3.6 突变率、突变类型的统计与计算 | 第48-50页 |
| 3.6.1 RE-qPCR | 第48-49页 |
| 3.6.2 测序结果 | 第49-50页 |
| 4. 讨论与展望 | 第50-55页 |
| 4.1 靶位点的设计 | 第50-51页 |
| 4.2 突变体检测方法 | 第51-52页 |
| 4.3 突变率、突变类型的分析 | 第52页 |
| 4.4 CRISPR-Cas9技术的展望 | 第52-55页 |
| 致谢 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-61页 |
