| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 前言 | 第11-23页 |
| 1.1 引言 | 第11页 |
| 1.2 K.marxianus酵母研究概况 | 第11-12页 |
| 1.3 酵母耐热机制的研究概况 | 第12-14页 |
| 1.4 乙醇脱氢酶 | 第14-15页 |
| 1.4.1 乙醇脱氢酶的性质 | 第14页 |
| 1.4.2 乙醇脱氢酶的类型 | 第14-15页 |
| 1.4.2.1 人体中的乙醇脱氢酶 | 第14-15页 |
| 1.4.2.2 细菌与酵母中的乙醇脱氢酶 | 第15页 |
| 1.4.2.3 含铁乙醇脱氢酶 | 第15页 |
| 1.5 乙醇脱氢酶分离纯化的研究进展 | 第15-17页 |
| 1.5.1 沉淀法纯化乙醇脱氢酶 | 第15-16页 |
| 1.5.1.1 硫酸铵沉淀 | 第15-16页 |
| 1.5.1.2 双水相沉淀 | 第16页 |
| 1.5.2 亲和层析分离纯化乙醇脱氢酶 | 第16-17页 |
| 1.5.2.1 金属亲和层析 | 第16页 |
| 1.5.2.2 染料亲和层析 | 第16-17页 |
| 1.6 乙醇脱氢酶应用研究进展 | 第17-19页 |
| 1.6.1 解酒药物方面的应用 | 第17页 |
| 1.6.2 食品科学中的应用 | 第17-18页 |
| 1.6.3 在疾病诊断中的应用 | 第18页 |
| 1.6.4 在生物工程中的应用 | 第18页 |
| 1.6.5 在生物传感器中的应用 | 第18-19页 |
| 1.7 不同来源乙醇脱氢酶的研究进展 | 第19-22页 |
| 1.7.1 人和动物乙醇脱氢酶的研究进展 | 第19页 |
| 1.7.2 植物乙醇脱氢酶的研究进展 | 第19-20页 |
| 1.7.3 微生物中乙醇脱氢酶的研究进展 | 第20-21页 |
| 1.7.4 K.marxianus酵母乙醇脱氢酶的研究进展 | 第21-22页 |
| 1.8 本课题研究内容和意义 | 第22-23页 |
| 第二章 材料和方法 | 第23-41页 |
| 2.1 材料 | 第23页 |
| 2.1.1 菌种和质粒 | 第23页 |
| 2.1.2 工具酶和试剂的配制 | 第23页 |
| 2.1.3 主要设备和仪器 | 第23页 |
| 2.2 方法和步骤 | 第23-41页 |
| 2.2.1 Kluyveromyces marxianus GX-15的培养 | 第24页 |
| 2.2.2 菌种的保藏 | 第24页 |
| 2.2.3 制备K.marxianus GX-15基因组总DNA | 第24-25页 |
| 2.2.4 乙醇脱氢酶基因(ADH4)的引物设计及PCR扩增 | 第25-26页 |
| 2.2.4.1 设计PCR引物 | 第25页 |
| 2.2.4.2 ADH4片段的PCR扩增 | 第25-26页 |
| 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 | 第26页 |
| 2.2.6 DNA的纯化方法 | 第26-28页 |
| 2.2.6.1 有机溶剂抽提琼脂糖凝胶中的DNA(参照《分子生物学操作指南》) | 第26-27页 |
| 2.2.6.2 试剂盒胶回收法纯化DNA | 第27-28页 |
| 2.2.6.3 DNA纯化试剂盒法纯化DNA | 第28页 |
| 2.2.7 制备大肠杆菌感受态细胞 | 第28-29页 |
| 2.2.8 大肠杆菌中质粒DNA的提取 | 第29-31页 |
| 2.2.8.1 大肠杆菌质粒DNA的大量制备(参照《分子克隆实验指南》 | 第29-30页 |
| 2.2.8.2 大肠杆菌质粒DNA的小量制备 | 第30-31页 |
| 2.2.8.3 试剂盒法小量制取质粒DNA | 第31页 |
| 2.2.9 DNA的酶切、连接于转化 | 第31-33页 |
| 2.2.9.1 PCR产物与pUCm 18-T Vector的连接转化 | 第31-32页 |
| 2.2.9.2 T-ADH4载体与pET-32a(+)载体的的酶切 | 第32-33页 |
| 2.2.9.3 ADH4基因与pET-32a(+)载体的连接转化 | 第33页 |
| 2.2.10 阳性重组子的筛选与验证 | 第33-34页 |
| 2.2.10.1 阳性重组子酶切验证 | 第33-34页 |
| 2.2.10.2 重组质粒PCR验证 | 第34页 |
| 2.2.10.3 重组质粒测序验证 | 第34页 |
| 2.2.11 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达与检测 | 第34-36页 |
| 2.2.11.1 重组质粒pET-32a(+)-ADH4转化表达宿主 | 第34-35页 |
| 2.2.11.2 重组表达菌小规模诱导培养 | 第35页 |
| 2.2.11.3 重组菌的大规模诱导培养 | 第35-36页 |
| 2.2.12 蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第36页 |
| 2.2.13 酶液的制备 | 第36-37页 |
| 2.2.14 酶的纯化 | 第37页 |
| 2.2.15 金属镍亲和层析柱的再生 | 第37-38页 |
| 2.2.16 测定蛋白质含量 | 第38页 |
| 2.2.17 重组乙醇脱氢酶(Adh4)酶活性测定 | 第38-41页 |
| 2.2.17.1 最适温度的测定 | 第39页 |
| 2.2.17.2 最适pH的测定 | 第39页 |
| 2.2.17.3 温度稳定性测定 | 第39页 |
| 2.2.17.4 pH稳定性测定 | 第39-40页 |
| 2.2.17.5 不同底物下酶活力的测定 | 第40页 |
| 2.2.17.6 米氏常数Km值的测定 | 第40-41页 |
| 第三章 结果与分析 | 第41-57页 |
| 3.1 构建K.marxianus GX-15 ADH4重组表达质粒 | 第41-45页 |
| 3.2 序列分析 | 第45-50页 |
| 3.2.1 GX-15 KmADH4基因序列 | 第45-46页 |
| 3.2.2 GX-15 KmADH4基因序列的分析 | 第46页 |
| 3.2.3 GX-15 KmADH4的氨基酸序列分析 | 第46-48页 |
| 3.2.4 GX-15 KmADH4氨基酸序列系统发育进化分析 | 第48-50页 |
| 3.3 ADH4基因在最coli Rosseta(DE3)中的诱导表达及其SDS-PAGE分析 | 第50-51页 |
| 3.4 重组乙醇脱氢酶(KmADH4)的酶学性质 | 第51-55页 |
| 3.4.1 酶的最适温度 | 第51页 |
| 3.4.2 酶的热稳定性 | 第51-52页 |
| 3.4.3 酶的最适pH | 第52-53页 |
| 3.4.4 酶的pH稳定性 | 第53-54页 |
| 3.4.5 不同底物下重组蛋白的酶活测定 | 第54页 |
| 3.4.6 米氏常数Km值的测定 | 第54-55页 |
| 小结与讨论 | 第55-57页 |
| 第四章 结论与展望 | 第57-59页 |
| 4.1 结论 | 第57页 |
| 4.2 展望 | 第57-59页 |
| 参考文献 | 第59-66页 |
| 致谢 | 第66-67页 |
| 在读期间发表学术论文情况 | 第67页 |
