| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 研究背景 | 第10-25页 |
| 1.1 胰蛋白酶 | 第10-18页 |
| 1.1.1 胰蛋白酶研究背景介绍 | 第10页 |
| 1.1.2 人胰蛋白酶的结构及作用机制 | 第10-13页 |
| 1.1.3 丝氨酸蛋白酶的催化机制 | 第13-14页 |
| 1.1.4 胰蛋白酶原与激活 | 第14-17页 |
| 1.1.5 人胰蛋白酶二硫键的研究 | 第17-18页 |
| 1.2 重组胰蛋白酶的研究进展 | 第18-21页 |
| 1.2.1 重组胰蛋白酶的克隆与表达 | 第18页 |
| 1.2.2 蛋白质折叠的研究 | 第18-20页 |
| 1.2.3 胰蛋白酶的应用 | 第20页 |
| 1.2.4 重组胰蛋白酶的优势 | 第20页 |
| 1.2.5 美国药典中对于重组胰蛋白酶的最新规定 | 第20-21页 |
| 1.3 胰蛋白酶的突变与疾病 | 第21-22页 |
| 1.4 有关于人阳离子型胰蛋白酶A121T位点的研究 | 第22-23页 |
| 1.5 课题目的及意义 | 第23-25页 |
| 第2章 材料与方法 | 第25-34页 |
| 2.1 实验材料与设备 | 第25-27页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第25页 |
| 2.1.2 常用试剂 | 第25-26页 |
| 2.1.3 常用实验设备 | 第26-27页 |
| 2.2 实验方法 | 第27-31页 |
| 2.2.1 重叠延伸PCR点突变的构建 | 第27页 |
| 2.2.2 目的基因的双酶切 | 第27-28页 |
| 2.2.3 重组质粒的构建及转化 | 第28页 |
| 2.2.4 重组质粒的菌液PCR鉴定 | 第28页 |
| 2.2.5 重组质粒的双酶切鉴定 | 第28-29页 |
| 2.2.6 重组质粒的表达鉴定 | 第29页 |
| 2.2.7 SDS-PAGE | 第29页 |
| 2.2.8 测序鉴定 | 第29页 |
| 2.2.9 超声破碎 | 第29页 |
| 2.2.10 包涵体的洗涤及复性 | 第29-30页 |
| 2.2.11 纯化预处理 | 第30页 |
| 2.2.12 CM-FF吸附最佳pH的确定 | 第30页 |
| 2.2.13 CM-FF最大吸附量的确定 | 第30页 |
| 2.2.14 CM-FF洗脱浓度的确定 | 第30页 |
| 2.2.15 CM-FF离子交换层析 | 第30-31页 |
| 2.3 酶学性质研究 | 第31-33页 |
| 2.3.1 最适pH | 第31页 |
| 2.3.2 pH稳定性研究 | 第31页 |
| 2.3.3 最适温度 | 第31页 |
| 2.3.4 温度稳定性研究 | 第31页 |
| 2.3.5 金属离子及其他试剂对酶活的影响 | 第31页 |
| 2.3.6 酶促反应动力学的测定 | 第31页 |
| 2.3.7 Bradford法测定蛋白浓度 | 第31-32页 |
| 2.3.8 Western blot的实验步骤 | 第32页 |
| 2.3.9 胰蛋白酶活力的检测 | 第32-33页 |
| 2.4 HPLC检测胰蛋白酶 | 第33页 |
| 2.4.1 流动相 | 第33页 |
| 2.4.2 色谱程序 | 第33页 |
| 2.5 结构分析及分子建模 | 第33-34页 |
| 第3章 重组人胰蛋白酶二硫键系列突变体的克隆表达纯化及性质研究 | 第34-46页 |
| 3.1 引言 | 第34页 |
| 3.2 实验结果及讨论 | 第34-45页 |
| 3.2.1 mhTg2-S139C、S139C-S206C、S139C-S206C-R122L突变体的构建 | 第34-35页 |
| 3.2.2 重组质粒的蛋白表达鉴定 | 第35-37页 |
| 3.2.3 重组质粒的测序鉴定 | 第37-38页 |
| 3.2.4 S139C、S139C-S206C-R122L突变体的复性 | 第38页 |
| 3.2.5 离子交换层析条件的选择 | 第38-41页 |
| 3.2.5.1 CM-FF吸附树脂对S139C、S139C-S206C-R122L突变体吸附pH的确定 | 第38页 |
| 3.2.5.2 CM-FF吸附树脂对S139C、S139C-S206C-R122L突变体吸附量的确定 | 第38-39页 |
| 3.2.5.3 CM-FF吸附树脂中目的蛋白NaCl洗脱浓度的确定 | 第39-40页 |
| 3.2.5.4 CM-FF离子交换层析 | 第40-41页 |
| 3.2.6 重组S139C、S139C-S206C-R122L突变体的部分性质研究 | 第41-43页 |
| 3.2.6.1 最适pH | 第41页 |
| 3.2.6.2 最适温度 | 第41-42页 |
| 3.2.6.3 金属离子及其他试剂对S139C、S139C-S206C酶活的影响 | 第42页 |
| 3.2.6.4 酶动力学参数的测定 | 第42-43页 |
| 3.2.7 hT1突变体C139S-C206S部分性质的研究 | 第43-45页 |
| 3.2.7.1 最适pH的研究 | 第43页 |
| 3.2.7.2 最适温度的研究 | 第43-44页 |
| 3.2.7.3 金属离子及其他试剂对mhT1-C139S-C206S酶活的影响 | 第44页 |
| 3.2.7.4 酶动力学参数的测定 | 第44-45页 |
| 3.3 本章小结 | 第45-46页 |
| 第4章 重组人胰蛋白酶S121A相关突变体的克隆表达纯化及性质研究 | 第46-54页 |
| 4.1 引言 | 第46页 |
| 4.2 实验结果及讨论 | 第46-52页 |
| 4.2.1 mht2-S139C-S206C-S121A、S121A-R122L、S139C-S206C-S121A-R122L、S121A、突变体的构建 | 第46-47页 |
| 4.2.2 重组质粒的蛋白表达鉴定 | 第47-48页 |
| 4.2.3 重组质粒的测序鉴定 | 第48页 |
| 4.2.4 突变体S121A、S139C-S206C-S121A、S139C-S206C-S121A-R122L及S121A-R122L的复性 | 第48页 |
| 4.2.5 离子交换层析条件的选择 | 第48-49页 |
| 4.2.6 CM-FF离子交换层析 | 第49-50页 |
| 4.2.7 S121A、S139C-S206C-S121A、S139C-S206C-S121A-R122L、S121A-R122L的性质研究 | 第50-52页 |
| 4.2.7.1 最适pH | 第50页 |
| 4.2.7.2 最适温度 | 第50-51页 |
| 4.2.7.3 金属离子对酶活的影响 | 第51-52页 |
| 4.2.7.4 酶促反应动力学的测定 | 第52页 |
| 4.3 本章小结 | 第52-54页 |
| 第5章 人胰蛋白酶突变体对稳定性的影响分析 | 第54-70页 |
| 5.1 引言 | 第54页 |
| 5.2 pH稳定性 | 第54-56页 |
| 5.2.1 胰蛋白酶二硫键系列突变体的pH稳定性比较 | 第54-55页 |
| 5.2.2 人阴离子型胰蛋白酶S121A系列突变体的pH稳定性比较 | 第55-56页 |
| 5.3 温度稳定性 | 第56-60页 |
| 5.3.1 人胰蛋白酶二硫键突变体的温度稳定性比较 | 第56-57页 |
| 5.3.2 人胰蛋白酶S121A系列突变体温度稳定性的比较 | 第57-60页 |
| 5.4 人胰蛋白酶HPLC分析结果 | 第60-62页 |
| 5.5 突变位点对人胰蛋白酶稳定性影响的分子结构分析 | 第62-69页 |
| 5.5.1 温度因子的分析 | 第62-67页 |
| 5.5.2 突变位点的三维结构分析 | 第67-69页 |
| 5.6 本章小结 | 第69-70页 |
| 第6章 结论与展望 | 第70-71页 |
| 参考文献 | 第71-75页 |
| 致谢 | 第75页 |
