| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第一章 绪论 | 第13-29页 |
| 1.1 铁在机体中的功能 | 第13页 |
| 1.2 机体内正常铁代谢 | 第13-14页 |
| 1.3 人体铁代谢调节 | 第14-16页 |
| 1.4 Hepcidin的生物学功能 | 第16-21页 |
| 1.4.1 Hepcidin的分子生物学特征 | 第16-18页 |
| 1.4.2 Hepcidin在铁代谢调节中的作用 | 第18-20页 |
| 1.4.3 Hepcidin与感染及炎症 | 第20页 |
| 1.4.4 Hepcidin与贫血、缺氧 | 第20-21页 |
| 1.5 Hepcidin的应用前景与制备方法 | 第21-22页 |
| 1.6 毕赤酵母Pichia pastoris表达体系 | 第22-28页 |
| 1.6.1 毕赤酵母表达载体 | 第23-24页 |
| 1.6.2 宿主菌株 | 第24-25页 |
| 1.6.3 外源基因的转化 | 第25页 |
| 1.6.4 外源基因表达方式 | 第25-26页 |
| 1.6.4.1 重组蛋白的胞内表达 | 第26页 |
| 1.6.4.2 重组蛋白的胞外分泌 | 第26页 |
| 1.6.5 外源蛋白表达优化 | 第26-27页 |
| 1.6.6 利用巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的研究现状 | 第27-28页 |
| 1.7 论文的研究思路 | 第28-29页 |
| 第二章 重组表达载体pPICZαA-Hepc的构建 | 第29-43页 |
| 2.1 DNA序列的设计与合成 | 第29-31页 |
| 2.2 重组表达载体pPICZαA-Hepc的构建 | 第31-38页 |
| 2.2.1 菌株与质粒 | 第31-32页 |
| 2.2.2 试剂 | 第32页 |
| 2.2.3 仪器设备 | 第32页 |
| 2.2.4 实验方法 | 第32-38页 |
| 2.2.4.1 PCR方法扩增目的片断 | 第32-33页 |
| 2.2.4.2 提取pPICZαA质粒 | 第33-35页 |
| 2.2.4.3 双酶切 | 第35页 |
| 2.2.4.4 目的片段的凝胶电泳回收 | 第35-36页 |
| 2.2.4.5 目的基因与pPICZαA载体的定向连接 | 第36页 |
| 2.2.4.6 大肠杆菌电转化 | 第36-37页 |
| 2.2.4.7 阳性重组子的筛选及鉴定 | 第37-38页 |
| 2.3 结果与分析 | 第38-42页 |
| 2.3.1 Hepcidin合成与天然序列的比较 | 第38-39页 |
| 2.3.2 目的片断的扩增及凝胶回收 | 第39-40页 |
| 2.3.3 阳性重组子的筛选及鉴定 | 第40-42页 |
| 2.4 本章小结 | 第42-43页 |
| 第三章 毕赤酵母GS115的电转化及高拷贝转化菌的筛选 | 第43-51页 |
| 3.1 实验材料 | 第43-44页 |
| 3.1.1 培养基及试剂 | 第43页 |
| 3.1.2 实验设备 | 第43-44页 |
| 3.2 实验方法 | 第44-48页 |
| 3.2.1 GS115电转化感受态的制备 | 第44页 |
| 3.2.2 电转化毕赤酵母 | 第44-45页 |
| 3.2.3 重组子的筛选及鉴定 | 第45-47页 |
| 3.2.4 高拷贝转化菌的筛选 | 第47页 |
| 3.2.5 筛选阳性克隆突变表型 | 第47-48页 |
| 3.3 结果与分析 | 第48-50页 |
| 3.3.1 重组子的筛选及鉴定 | 第48-49页 |
| 3.3.2 高拷贝转化菌的筛选 | 第49页 |
| 3.3.3 筛选阳性克隆突变表型 | 第49-50页 |
| 3.4 本章小结 | 第50-51页 |
| 第四章 重组毕赤酵母的诱导表达及鉴定 | 第51-63页 |
| 4.1 实验材料 | 第51-52页 |
| 4.1.1 菌株 | 第51页 |
| 4.1.2 培养基及试剂 | 第51页 |
| 4.1.3 仪器设备 | 第51-52页 |
| 4.2 实验方法 | 第52-57页 |
| 4.2.1 诱导表达 | 第52页 |
| 4.2.2 蛋白浓度的测定 | 第52-53页 |
| 4.2.3 Tricine-SDS-PAGE电泳 | 第53-56页 |
| 4.2.3.1 凝胶贮液及电泳缓冲 | 第53-54页 |
| 4.2.3.2 电泳样品的制备 | 第54页 |
| 4.2.3.3 电泳 | 第54-56页 |
| 4.2.4 摇瓶表达条件的优化 | 第56页 |
| 4.2.4.1 温度对重组Hepcidin表达的影响 | 第56页 |
| 4.2.4.2 诱导时间对重组Hepcidin表达的影响 | 第56页 |
| 4.2.4.3 甲醇浓度对重组Hepcidin表达的影响 | 第56页 |
| 4.2.5 重组蛋白抑菌活性检验 | 第56-57页 |
| 4.3 结果与分析 | 第57-62页 |
| 4.3.1 蛋白浓度的测定 | 第57页 |
| 4.3.2 Tricine-SDS-PAGE电泳 | 第57-59页 |
| 4.3.3 摇瓶表达条件的优化 | 第59-61页 |
| 4.3.3.1 温度 | 第59-60页 |
| 4.3.3.2 甲醇浓度和诱导时间 | 第60-61页 |
| 4.3.4 体外抑菌活性检验 | 第61-62页 |
| 4.4 本章小结 | 第62-63页 |
| 第五章 目标蛋白的分离纯化 | 第63-71页 |
| 5.1 实验材料 | 第63页 |
| 5.1.1 试剂 | 第63页 |
| 5.1.2 仪器 | 第63页 |
| 5.2 实验方法 | 第63-67页 |
| 5.2.1 沉淀法 | 第64页 |
| 5.2.2 中空纤维超滤 | 第64-65页 |
| 5.2.3 Sephadex G-25凝胶层析 | 第65-67页 |
| 5.3 结果与分析 | 第67-70页 |
| 5.3.1 等电点及硫酸铵分级沉淀 | 第67-68页 |
| 5.3.2 中空纤维超滤 | 第68-69页 |
| 5.3.3 Sephadex G-25凝胶层析 | 第69-70页 |
| 5.4 本章小结 | 第70-71页 |
| 第六章 结论 | 第71-73页 |
| 参考文献 | 第73-77页 |
| 附录 | 第77-81页 |
| 致谢 | 第81-82页 |
| 研究成果及发表的学术论文 | 第82-83页 |
| 作者及导师简介 | 第83-84页 |
| 附件 | 第84-85页 |
