| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 1 文献综述 | 第13-17页 |
| 1.1 植物抗冻蛋白及其编码基因 | 第13-14页 |
| 1.1.1 植物抗冻蛋白 | 第13-14页 |
| 1.1.2 植物抗冻蛋白基因的克隆与功能验证 | 第14页 |
| 1.2 矮沙冬青 | 第14-16页 |
| 1.2.1 沙冬青的种类及分布 | 第14-15页 |
| 1.2.2 矮沙冬青生物学特性 | 第15页 |
| 1.2.3 沙冬青抗冻蛋白及其编码基因 | 第15-16页 |
| 1.3 本研究的目的和意义 | 第16-17页 |
| 2 材料和方法 | 第17-36页 |
| 2.1 技术路线 | 第17页 |
| 2.2 实验方法 | 第17-36页 |
| 2.2.1 推导的AnAFP蛋白的生物信息学分析 | 第17-18页 |
| 2.2.2 AnAFP基因开放阅读框的克隆 | 第18-20页 |
| 2.2.2.1 引物设计 | 第18页 |
| 2.2.2.2 CTAB法提取基因组DNA | 第18页 |
| 2.2.2.3 PCR扩增反应及胶回收 | 第18-19页 |
| 2.2.2.4 回收产物加多聚腺苷化反应 | 第19页 |
| 2.2.2.5 连接PMD19-T载体 | 第19页 |
| 2.2.2.6 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第19-20页 |
| 2.2.3 构建pET-32a-AnAFP原核表达载体 | 第20-22页 |
| 2.2.3.1 引物设计及PCR扩增 | 第21页 |
| 2.2.3.2 双酶切PCR回收产物与pET-32a载体 | 第21-22页 |
| 2.2.3.3 连接、转化与筛选 | 第22页 |
| 2.2.4 目的蛋白诱导表达 | 第22-24页 |
| 2.2.4.1 试剂配制 | 第22-23页 |
| 2.2.4.2 IPTG诱导AnAFP蛋白表达及SDS-PAGE电泳检测 | 第23页 |
| 2.2.4.3 低温条件下大肠杆菌存活率的测定 | 第23-24页 |
| 2.2.5 构建pRI201-GUS-AnAFP植物表达载体 | 第24-27页 |
| 2.2.5.1 构建中间载体pRI201-AnAFP | 第25-26页 |
| 2.2.5.1.1 引物设计及PCR扩增 | 第25页 |
| 2.2.5.1.2 双酶切PCR回收产物和pRI201-GUS载体 | 第25-26页 |
| 2.2.5.1.3 连接,转化与筛选 | 第26页 |
| 2.2.5.2 通过中间载体构建pRI201-GUS-AnAFP | 第26-27页 |
| 2.2.5.2.1 引物设计及PCR扩增 | 第26-27页 |
| 2.2.5.2.2 双酶切PCR回收产物和pRI201-GUS载体 | 第27页 |
| 2.2.5.2.3 连接,转化与筛选 | 第27页 |
| 2.2.6 农杆菌介导的植物表达载体pRI201-GUS-AnAFP转化烟草 | 第27-32页 |
| 2.2.6.1 植物培养基 | 第27-28页 |
| 2.2.6.2 农杆菌菌液的制备 | 第28页 |
| 2.2.6.3 农杆菌介导的烟草转化 | 第28-29页 |
| 2.2.6.4 转基因植株的检测 | 第29-32页 |
| 2.2.6.4.1 再生植株的PCR检测 | 第29页 |
| 2.2.6.4.2 阳性苗叶片的GUS染色 | 第29-30页 |
| 2.2.6.4.3 转基因T_1代株系Southern杂交检测 | 第30-32页 |
| 2.2.7 荧光定量PCR检测AnAFP表达量 | 第32-34页 |
| 2.2.7.1 材料处理和总RNA提取 | 第32-33页 |
| 2.2.7.2 RNA反转录成cDNA | 第33页 |
| 2.2.7.3 荧光定量PCR | 第33-34页 |
| 2.2.8 转基因烟草的抗寒性检测 | 第34-36页 |
| 2.2.8.1 低温胁迫条件下转基因烟草的相对电导率的测定 | 第34-35页 |
| 2.2.8.2 低温胁迫处理后转基因烟草和野生型烟草的表型观察 | 第35-36页 |
| 3 结果与分析 | 第36-52页 |
| 3.1 推导的AnAFP蛋白的生物信息学分析结果 | 第36-37页 |
| 3.2 矮沙冬青抗冻蛋白基因ORF | 第37-38页 |
| 3.2.1 矮沙冬青抗冻蛋白基因ORF的PCR扩增产物 | 第37页 |
| 3.2.2 重组菌落的PCR鉴定 | 第37-38页 |
| 3.2.3 阳性克隆的测序结果 | 第38页 |
| 3.3 构建pET32a-AnAFP原核表达载体结果 | 第38-39页 |
| 3.3.1 酶切位点的添加 | 第38页 |
| 3.3.2 重组子pET32a-AnAFP的鉴定 | 第38-39页 |
| 3.4 融合蛋白的诱导表达 | 第39-40页 |
| 3.5 低温条件下大肠杆菌存活率的测定 | 第40-42页 |
| 3.6 构建植物表达载体pRI201-GUS-AnAFP | 第42-44页 |
| 3.6.1 构建中间载体pRI201-AnAFP | 第42-43页 |
| 3.6.1.1 酶切位点的添加 | 第42页 |
| 3.6.1.2 鉴定中间载体pRI201-AnAFP | 第42-43页 |
| 3.6.2 通过中间载体pRI201-AnAFP构建表达载体pRI201-GUS-AnAFP | 第43-44页 |
| 3.7 农杆菌介导的植物表达载体pRI201-GUS-AnAFP转化烟草 | 第44-48页 |
| 3.7.1 农杆菌介导的烟草转化 | 第44-45页 |
| 3.7.2 转基因植株的检测 | 第45-48页 |
| 3.7.2.1 T_0代转基因烟草的PCR检测 | 第45-46页 |
| 3.7.2.2 T_0代转基因烟草的GUS染色 | 第46页 |
| 3.7.2.3 T_1代转基因烟草的PCR鉴定 | 第46页 |
| 3.7.2.4 T_1代转基因烟草的GUS染色 | 第46-47页 |
| 3.7.2.5 转基因T_1代株系基因组DNA Southern杂交检测 | 第47页 |
| 3.7.2.6 T_2代株系检测 | 第47-48页 |
| 3.8 AnAFP基因在低温胁迫下的表达 | 第48-50页 |
| 3.8.1 内参基因EF1-α和AnAFP基因的引物特异性 | 第48-49页 |
| 3.8.2 内参基因EF1-α和AnAFP基因的标准曲线 | 第49页 |
| 3.8.3 AnAFP基因在低温胁迫下的表达模式 | 第49-50页 |
| 3.9 转基因烟草抗寒性检测 | 第50-52页 |
| 3.9.1 低温处理下相对电导率的测定结果 | 第50页 |
| 3.9.2 低温处理后植株的表型鉴定 | 第50-52页 |
| 4 讨论 | 第52-54页 |
| 4.1 大肠杆菌异源表达系统 | 第52页 |
| 4.2 pET-32a质粒表达对宿主菌的影响 | 第52页 |
| 4.3 AnAFP基因异源表达受低温胁迫的影响 | 第52-53页 |
| 4.4 AnAFP的耐寒性机制 | 第53页 |
| 4.5 展望 | 第53-54页 |
| 参考文献 | 第54-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 攻读硕士学位期间发表论文 | 第62页 |
