| 摘要 | 第5-8页 |
| Abstract | 第8-11页 |
| 第一章 前言 | 第17-37页 |
| 1.1 链霉菌中次级代谢调控研究概况 | 第17-22页 |
| 1.1.1 磷酸盐调控 | 第17-19页 |
| 1.1.2 通过氮源调控次级代谢途径 | 第19页 |
| 1.1.3 通过碳源代谢调控实现抗生素合成途径的调控 | 第19-20页 |
| 1.1.4 破坏细胞内锌离子和铁离子的平衡实现对抗生素合成途径的调控 | 第20页 |
| 1.1.5 利用营养物缺乏时的应急反应对次级代谢途径的调控 | 第20-21页 |
| 1.1.6 信号传导末端的信号传导器对次级代谢产物合成的影响 | 第21-22页 |
| 1.2 ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白家族研究概况 | 第22-25页 |
| 1.2.1 ABC蛋白的结构 | 第22-24页 |
| 1.2.2 ABC转运系统在细菌中的生理功能 | 第24-25页 |
| 1.2.3 ABC转运蛋白对次级代谢产物合成的影响 | 第25页 |
| 1.3 Lrp/AsnC转录调控因子蛋白家族研究概况 | 第25-29页 |
| 1.3.1 Lrp/AsnC家族调控因子的调控功能 | 第25-26页 |
| 1.3.2 Lrp/AsnC家族蛋白与DNA的结合 | 第26-28页 |
| 1.3.4 Lrp/AsnC类似蛋白与效应因子的结合 | 第28-29页 |
| 1.4 S.rimosus中土霉素合成研究概况 | 第29-35页 |
| 1.4.1 S.rimosus中的OTC合成途径 | 第29-30页 |
| 1.4.2 OTC合成基因簇 | 第30-32页 |
| 1.4.3 OTC合成途径的代谢调控 | 第32-33页 |
| 1.4.4 Ⅱ型最小(minimal)PKS系统 | 第33-35页 |
| 1.5 本研究的内容和意义 | 第35-37页 |
| 第二章 材料与方法 | 第37-75页 |
| 2.1 菌株 | 第37页 |
| 2.2 质粒 | 第37-39页 |
| 2.3 引物 | 第39-41页 |
| 2.4 培养基 | 第41页 |
| 2.5 实验试剂 | 第41-42页 |
| 2.5.1 酶制剂 | 第41页 |
| 2.5.2 生化试剂 | 第41-42页 |
| 2.5.3 常规生化试剂 | 第42页 |
| 2.6 实验设备 | 第42-43页 |
| 2.7 菌株的培养条件 | 第43页 |
| 2.8 S.rimosus的基因组DNA的提取 | 第43页 |
| 2.9 DNA琼脂糖凝胶电泳 | 第43页 |
| 2.10 PCR扩增 | 第43-44页 |
| 2.11 DNA片段纯化 | 第44页 |
| 2.12 质粒DNA的提取 | 第44页 |
| 2.13 限制性内切酶酶切反应 | 第44-45页 |
| 2.14 DNA片段的连接 | 第45页 |
| 2.15 大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第45页 |
| 2.16 质粒转化大肠杆菌感受态细胞 | 第45-46页 |
| 2.17 DNA的测序 | 第46页 |
| 2.18 质粒的去甲基化 | 第46页 |
| 2.19 电转化用S.rimosus感受态细胞的制备 | 第46-47页 |
| 2.20 S.rimosus中质粒的电转化 | 第47页 |
| 2.21 S.rimosus总RNA的提取及逆转录合成cDNA | 第47-48页 |
| 2.21.1 S.rimosus总RNA的提取 | 第47页 |
| 2.21.2 cDNA的合成 | 第47-48页 |
| 2.22 实时荧光定量PCR(RT-qPCR) | 第48页 |
| 2.23 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第48-50页 |
| 2.23.1 12%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第48-49页 |
| 2.23.2 7%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE) | 第49-50页 |
| 2.24 Western Blotting分析 | 第50页 |
| 2.25 重组蛋白的分离纯化 | 第50-51页 |
| 2.25.1 缓冲液的配制 | 第50页 |
| 2.25.2 镍柱亲和层析 | 第50-51页 |
| 2.26 DNA凝胶阻滞(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)实验 | 第51页 |
| 2.27 DNase Ⅰ Footprinting分析 | 第51-52页 |
| 2.27.1 缓冲液配制 | 第51页 |
| 2.27.2 Footpriting检测 | 第51-52页 |
| 2.28 Southern Blotting分析 | 第52-53页 |
| 2.28.1 探针的标记 | 第52页 |
| 2.28.2 膜的制备 | 第52页 |
| 2.28.3 DNA印迹杂交 | 第52-53页 |
| 2.29 大肠杆菌重组菌的构建 | 第53-59页 |
| 2.29.1 重组大肠杆菌E.coli/pETC02的构建 | 第53-56页 |
| 2.29.2 重组大肠杆菌Rosetta(DE3)/)pET28a-rgC的构建 | 第56-57页 |
| 2.29.3 重组大肠杆菌Rosetta(DE3)/pET28a-mgCs的构建 | 第57-59页 |
| 2.30 S.rimosus模式菌M4018重组菌的构建 | 第59-68页 |
| 2.30.1 S rimosus模式菌M4018的otrC过量表达突变株的构建 | 第59-61页 |
| 2.30.2 S.rimosus模式菌M4018的otrC基因阻断突变株的构建 | 第61-63页 |
| 2.30.3 S.rimosus模式菌M4018的rgC敲入突变株菌株的构建 | 第63-64页 |
| 2.30.4 S rimosus模式菌M4018的rgC敲除突变株的构建 | 第64-66页 |
| 2.30.5 M4018::rgC突变株的rgC回补突变株的构建 | 第66-67页 |
| 2.30.6 S.rimosus模式菌M4018的oxyABC基因过量表达突变株的构建 | 第67-68页 |
| 2.31 S.rimosus工业高产菌突变株的构建 | 第68-70页 |
| 2.31.1 otrC过量表达突变株的构建 | 第68-69页 |
| 2.31.2 otrC阻断突变株的构建 | 第69页 |
| 2.31.3 rgC敲入突变株的构建 | 第69页 |
| 2.31.4 rgC敲除突变株的构建 | 第69页 |
| 2.31.5 rgC回补突变株的构建 | 第69页 |
| 2.31.6 oxyABC过量表达突变株的构建 | 第69-70页 |
| 2.32 外源基因在重组大肠杆菌中的诱导表达 | 第70页 |
| 2.33 ATPase酶活力进行测定 | 第70页 |
| 2.34 溴化乙锭(ethidium bromide,EB)转运功能的测定 | 第70-71页 |
| 2.34.1 重组大肠杆菌的诱导培养及菌体收集 | 第70-71页 |
| 2.34.2 EB转运活性的测定 | 第71页 |
| 2.34.3 抑制剂Ortho-vanadate对大肠杆菌重组菌EB转运功能的影响 | 第71页 |
| 2.35 细胞耐药性的测定 | 第71-72页 |
| 2.35.1 大肠杆菌重组菌的最小抑菌浓度测定 | 第71页 |
| 2.35.2 药物对S.rimosus的最小抑菌浓度的测定 | 第71-72页 |
| 2.36 S.rimosus的OTC发酵 | 第72页 |
| 2.36.1 在天然发酵培养基中的发酵 | 第72页 |
| 2.36.2 在合成培养基中的发酵 | 第72页 |
| 2.36.3 高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)分析发酵液中OTC含量 | 第72页 |
| 2.37 发酵过程中菌体干重的测定 | 第72页 |
| 2.38 L-天冬氨酸的测定 | 第72-74页 |
| 2.38.1 样品的处理 | 第72-73页 |
| 2.38.2 HPLC分析L-天冬氨酸含量 | 第73-74页 |
| 2.39 发酵过程中有机酸总量变化的检测 | 第74-75页 |
| 第三章 S.rimosus中一个ABC转运蛋白OtrC的功能分析及其对OTC合成的调控作用 | 第75-93页 |
| 3.1 前言 | 第75页 |
| 3.2 OtrC蛋白序列的同源性分析及机构预测 | 第75-78页 |
| 3.3 OtrC蛋白在大肠杆菌中的异源表达 | 第78-80页 |
| 3.3.1 重组大肠杆菌E.coB/pETC02的构建 | 第78页 |
| 3.3.2 OtrC蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 | 第78-80页 |
| 3.4 OtrC蛋白ATPase活力的测定 | 第80页 |
| 3.5 OtrC蛋白转运功能的鉴定 | 第80-82页 |
| 3.6 S.rimosus模式菌M4018的otrC敲入突变株的构建 | 第82-83页 |
| 3.7 S.rimosus模式菌M4018的otrC基因阻断突变株的构建 | 第83-84页 |
| 3.8 OtrC基因的表达对细胞耐药性的影响 | 第84-88页 |
| 3.8.1 OtrC基因的表达对大肠杆菌BL21(DE3)细胞耐药性的影响 | 第84-86页 |
| 3.8.2 OtrC基因的表达对S.rimosus模式菌M4018细胞耐药性的影响 | 第86-88页 |
| 3.9 OtrC表达对S.rimosus模式菌M4018中OTC合成的影响 | 第88-89页 |
| 3.10 RT-qPCR分析不同S. rimosus突变株中otrC基因的表达量 | 第89-91页 |
| 3.10.1 总RNA的提取及cDNA的合成 | 第89页 |
| 3.10.2 标准曲线的绘制 | 第89-90页 |
| 3.10.3 otrC基因转录水平的分析 | 第90-91页 |
| 3.11 讨论 | 第91-92页 |
| 3.12 本章小结 | 第92-93页 |
| 第四章 S.rimosus模式菌M4018中转录调控因子RgC功能的分析及其对OTC合成途径的调控 | 第93-116页 |
| 4.1 引言 | 第93-94页 |
| 4.2 rgC基因在大肠杆菌中的克隆及表达 | 第94-96页 |
| 4.2.1 重组大肠杆菌Rosetta(DE3)/pET28a-rgC的构建 | 第94页 |
| 4.2.2 His_6-RgC蛋白的表达及纯化 | 第94-96页 |
| 4.3 EMSA分析RgC与启动子DNA的体外结合 | 第96-97页 |
| 4.4 氨基酸的添加对RgC与目的DNA结合的影响 | 第97-98页 |
| 4.5 RgC蛋白的定点突变对其DNA结合能力的影响 | 第98-101页 |
| 4.6 DNase Ⅰ footprinting分析RgC结合位点 | 第101-103页 |
| 4.7 M4018中rgC敲入和敲除突变株的构建 | 第103-109页 |
| 4.7.1 rgC敲入突变株的构建 | 第103-105页 |
| 4.7.2 rgC敲除突变株的构建 | 第105-108页 |
| 4.7.3 rgC回补突变株的构建 | 第108-109页 |
| 4.8 S.rimosus突变菌株中基因转录水平的分析 | 第109-111页 |
| 4.9 RgC对S rimosus模式菌M4018中OTC合成的调控作用 | 第111-112页 |
| 4.10 RgC对S rimosus模式菌M4018天冬氨酸代谢途径及菌体生长的影响 | 第112页 |
| 4.11 RgC蛋白对菌体生长的影响 | 第112-113页 |
| 4.12 讨论 | 第113-114页 |
| 4.13 本章小结 | 第114-116页 |
| 第五章 S.rimosus中minimal PKS对菌体生长及OTC合成的调控 | 第116-126页 |
| 5.1 引言 | 第116页 |
| 5.2 重组质粒pSET152-ermE~p-oxyABC(pSEM)的验证 | 第116-117页 |
| 5.3 S.rimosus模式菌M4018的oxyABC基因过量表达突变株的构建 | 第117-118页 |
| 5.4 minimal PKS基因过量表达对S.rimosus模式菌M4018表型的影响 | 第118-119页 |
| 5.5 minimal PKS基因过量表达对发酵过程中S.rimosus模式菌M4018菌体生长的影响 | 第119-120页 |
| 5.6 minimal PKS基因过量表达对S.rimosus模式菌M4018 OTC产量的影响 | 第120-121页 |
| 5.7 minimal PKS基因过量表达对M4018中初级代谢途径通量影响的初步分析 | 第121-122页 |
| 5.8 minimal PKS基因及otrB抗性基因表达水平的分析 | 第122-124页 |
| 5.9 讨论 | 第124-125页 |
| 5.10 本章小结 | 第125-126页 |
| 第六章 工业高产菌中OTC合成的代谢调控 | 第126-144页 |
| 6.1 引言 | 第126-127页 |
| 6.2 otrC基因的过量表达和阻断对工业高产菌SR16中OTC产量的影响 | 第127-130页 |
| 6.2.1 工业生产菌otrC过量表达突变株的构建 | 第127-128页 |
| 6.2.2 工业生产菌otrC阻断突变株的构建 | 第128-129页 |
| 6.2.3 otrC基因的过量表达和阻断对工业菌SR16中OTC产量的影响 | 第129页 |
| 6.2.4 otrC基因的过量表达和阻断突变株中otrC基因的转录水平分析 | 第129-130页 |
| 6.3 rgC基因的过量表达和敲除对工业高产菌SR16中OTC产量的影响 | 第130-136页 |
| 6.3.1 工业高产菌SR16的rgC基因过量表达突变株的构建 | 第130-131页 |
| 6.3.2 工业高产菌SR16的rgC敲除突变株的构建 | 第131-133页 |
| 6.3.3 rgC回补突变株的构建 | 第133页 |
| 6.3.4 rgC基因过量表达和敲除对工业高产菌SR16中OTC产量的影响 | 第133-135页 |
| 6.3.5 SR16突变株中rgC基因转录水平的分析 | 第135-136页 |
| 6.4 minimal PKS基因的过量表达对工业高产菌SR16的表型、菌体生长及OTC生产能力的影响 | 第136-140页 |
| 6.4.1 SR16的minimal PKS基因过量表达突变株的构建 | 第136-137页 |
| 6.4.2 minimal PKS过量表达对SR16菌体形态的影响 | 第137页 |
| 6.4.3 minimal PKS过量表达对SR16菌丝和孢子发育的影响 | 第137-138页 |
| 6.4.4 minimal PKS基因过量表达对发酵过程中S.rimosus SR16菌体生长的影响 | 第138-139页 |
| 6.4.5 minimal PKS基因过量表达对S.rimosus SR16中OTC产量的影响 | 第139-140页 |
| 6.5 S.rimosus SR16突变株中初级代谢途径通量变化的初步分析 | 第140页 |
| 6.6 S.rimosus SR16及其突变株中minimal PKS基因及otrB抗性基因表达水平的分析 | 第140-141页 |
| 6.7 讨论 | 第141-142页 |
| 6.8 本章小结 | 第142-144页 |
| 第七章 结论与展望 | 第144-146页 |
| 7.1 结论 | 第144页 |
| 7.2 展望 | 第144-146页 |
| 参考文献 | 第146-161页 |
| 致谢 | 第161-162页 |
| 攻读博士期间发表的论文及专利 | 第162页 |
