| 摘耍 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 符号说明 | 第10-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-17页 |
| 1.1 α-淀粉酶 | 第11页 |
| 1.2 GH13_37亚家族 | 第11-12页 |
| 1.3 生淀粉降解酶(RSDE) | 第12-13页 |
| 1.4 AmyP | 第13-14页 |
| 1.5 本研究的目的,意义及主要研究内容 | 第14页 |
| 1.6 蛋白质晶体学简介及晶体学方法 | 第14-16页 |
| 1.7 研究路线图 | 第16-17页 |
| 第二章 α-淀粉酶AmyP的异源表达纯化 | 第17-42页 |
| 2.1 实验材料与方法 | 第17-19页 |
| 2.1.1 仪器设备 | 第17-18页 |
| 2.1.2 实验材料和试剂 | 第18-19页 |
| 2.1.2.1 菌株、载体 | 第18页 |
| 2.1.2.2 试剂与酶 | 第18-19页 |
| 2.2 实验方法 | 第19-35页 |
| 2.2.1 培养基及试剂的配制 | 第19-24页 |
| 2.2.1.1 培养基的配制 | 第19页 |
| 2.2.1.2 试剂的配制 | 第19-21页 |
| 2.2.1.3 E.coli BL21(DE3)感受态细胞的制备 | 第21页 |
| 2.2.1.4 聚丙烯酰胺凝胶的配制 | 第21-22页 |
| 2.2.1.5 DNS的配制 | 第22-23页 |
| 2.2.1.6 TEV酶的制备 | 第23-24页 |
| 2.2.2 α-淀粉酶AmyP表达克隆的构建 | 第24-31页 |
| 2.2.2.1 扩增α-淀粉酶amyp基因 | 第24-25页 |
| 2.2.2.2 目的基因PCR产物胶回收 | 第25-26页 |
| 2.2.2.3 pET28a(tev)载体制备 | 第26页 |
| 2.2.2.4 目的基因和载体双酶切 | 第26-27页 |
| 2.2.2.5 双酶切后的目的基因和载体胶回收 | 第27页 |
| 2.2.2.6 双酶切胶回收后的amyp基因和pET28a(tev)载体连接 | 第27-28页 |
| 2.2.2.7 连接产物化学法转化 | 第28页 |
| 2.2.2.8 验证阳性克隆 | 第28-29页 |
| 2.2.2.9 测序结果处理 | 第29页 |
| 2.2.2.10 AmyP蛋白可溶表达检测 | 第29-30页 |
| 2.2.2.11 AmyP粗酶液酶活检测 | 第30-31页 |
| 2.2.3 AmyP酶活缺失突变体AmyP-E221Q克隆的构建 | 第31-33页 |
| 2.2.3.1 突变引物的设计 | 第31页 |
| 2.2.3.2 amyp -E221Q突变基因的获得 | 第31-32页 |
| 2.2.3.3 amyp-E221Q目的基因PCR产物胶回收 | 第32页 |
| 2.2.3.4 Blunting Kination反应 | 第32页 |
| 2.2.3.5 Ligation反应 | 第32页 |
| 2.2.3.6 pET28a-amyp-E221Q重组质粒化学法转化 | 第32-33页 |
| 2.2.3.7 测序结果处理 | 第33页 |
| 2.2.4 AmyP酶活缺失突变体AmyP-E221Q粗酶液酶活检测 | 第33页 |
| 2.2.4.1 AmyP-E221Q蛋白试表达 | 第33页 |
| 2.2.4.2 AmyP-E221Q粗酶液酶活检测 | 第33页 |
| 2.2.5 AmyP-E221Q蛋白大量表达纯化 | 第33-35页 |
| 2.2.5.1 菌体培养 | 第33页 |
| 2.2.5.2 菌体破碎 | 第33页 |
| 2.2.5.3 AmyP蛋白的镍柱纯化 | 第33页 |
| 2.2.5.4 AmyP蛋白透析TEV酶切 | 第33-34页 |
| 2.2.5.5 AmyP蛋白透析TEV酶切后反挂镍柱 | 第34页 |
| 2.2.5.6 AmyP蛋白分子筛纯化 | 第34页 |
| 2.2.5.7 AmyP蛋白阴离子交换柱进一步纯化 | 第34页 |
| 2.2.5.8 AmyP蛋白纯化后Tricine-SDS-PAGE检测 | 第34-35页 |
| 2.3 实验结果 | 第35-40页 |
| 2.3.1 α-淀粉酶AmyP克隆的构建 | 第35-37页 |
| 2.3.1.1 α-淀粉酶amyp基因PCR扩增 | 第35页 |
| 2.3.1.2 pET28a(tev)质粒提取 | 第35页 |
| 2.3.1.3 目的基因和载体双酶切 | 第35-36页 |
| 2.3.1.4 菌落PCR法验证阳性克隆 | 第36页 |
| 2.3.1.5 AmyP蛋白可溶表达情况检测 | 第36-37页 |
| 2.3.1.6 AmyP粗酶液酶活检测 | 第37页 |
| 2.3.2 AmyP酶活缺失突变体pET28a-amyp-E221Q克隆的构建 | 第37-38页 |
| 2.3.2.1 pET28a-amyp-E221Q突变质粒PCR | 第37-38页 |
| 2.3.2.2 pET28a-amyp-E221Q突变体测序结果比对 | 第38页 |
| 2.3.3 AmyP酶活缺失突变体AmyP-E221Q粗酶液酶活检测 | 第38页 |
| 2.3.4 AmyP-E221Q蛋白的表达纯化 | 第38-40页 |
| 2.3.4.1 AmyP-E221Q蛋白分子筛纯化结果 | 第38-39页 |
| 2.3.4.2 AmyP-E221Q蛋白分子筛第三个峰MonoQ阴离子交换住纯化结果 | 第39-40页 |
| 2.4 讨论 | 第40-42页 |
| 第三章 AmyP-E221Q蛋白的晶体生长和结构解析 | 第42-54页 |
| 3.1 实验材料 | 第42-43页 |
| 3.1.1 仪器设备 | 第42页 |
| 3.1.2 试剂 | 第42-43页 |
| 3.2 实验方法 | 第43-46页 |
| 3.2.1 晶体优化试剂的配制 | 第43页 |
| 3.2.2 AmyP-E221Q与底物γ-CD的晶体初筛 | 第43页 |
| 3.2.3 AmyP-E221Q与底物γ-CD的晶体优化 | 第43-44页 |
| 3.2.4 AmyP-E221Q晶体数据收集与结构解析 | 第44-45页 |
| 3.2.5 AmyP-SBD克隆构建与蛋白表达纯化 | 第45页 |
| 3.2.5.1 AmyP-SBD引物的设计 | 第45页 |
| 3.2.5.2 AmyP-SBD克隆的构建 | 第45页 |
| 3.2.5.3 AmyP-SBD蛋白表达纯化 | 第45页 |
| 3.2.6 AmyP-SBD蛋白圆二色谱(CD)检测 | 第45-46页 |
| 3.3 实验结果 | 第46-53页 |
| 3.3.1 AmyP-E221Q与底物γ-CD的晶体初筛结果 | 第46页 |
| 3.3.2 AmyP-E221Q与底物γ-CD的晶体优化结果 | 第46-47页 |
| 3.3.3 AmyP-E221Q晶体数据收集、修正与结构解析 | 第47-51页 |
| 3.3.4 AmyP-E221Q晶体SDS-PAGE和质谱检测 | 第51-53页 |
| 3.4 讨论 | 第53-54页 |
| 第四章 α-淀粉酶AmyP的结构分析与突变验证 | 第54-80页 |
| 4.1 实验材料 | 第54-55页 |
| 4.1.1 仪器设备 | 第54页 |
| 4.1.2 试剂 | 第54-55页 |
| 4.2 实验方法 | 第55-64页 |
| 4.2.1 试剂的配制 | 第55页 |
| 4.2.2 AmyP蛋白晶体结构的分析 | 第55页 |
| 4.2.3 AmyP基于结构基础的突变体构建 | 第55-56页 |
| 4.2.4 AmyP各突变体蛋白的表达纯化 | 第56页 |
| 4.2.5 AmyP各突变体的酶学性质检测 | 第56-64页 |
| 4.2.5.1 改良型Bradford法检测蛋白浓度 | 第56-57页 |
| 4.2.5.2 DNS法测比酶活和酶的热稳定性 | 第57-60页 |
| 4.2.5.3 CuBic法进行动力学分析 | 第60-62页 |
| 4.2.5.4 圆二色谱法检测蛋白的二级结构 | 第62页 |
| 4.2.5.5 荧光光谱分析蛋白的三级结构 | 第62页 |
| 4.2.5.6 薄层层析分析水解产物 | 第62-63页 |
| 4.2.5.7 高效液相色谱法(HPLC)分析酶的水解产物 | 第63-64页 |
| 4.3 实验结果 | 第64-78页 |
| 4.3.1 Domain B很短 | 第64-68页 |
| 4.3.2 DomainA边缘结合两个Ca~(2+) | 第68-72页 |
| 4.3.3 新颖的-3底物结合位点 | 第72-76页 |
| 4.3.4 表面糖结合位点(SBSs) | 第76-78页 |
| 4.4 讨论 | 第78-80页 |
| 结论 | 第80-82页 |
| 参考文献 | 第82-88页 |
| 附录 | 第88-89页 |
| 致谢 | 第89-90页 |
| 研究生期间发表论文情况 | 第90页 |
