| 第—部分: EV71 2C解旋酶的结构与功能研究 | 第7-71页 |
| 摘要 | 第7-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 1. 引言 | 第10-27页 |
| 1.1 EV71的流行病学 | 第10-14页 |
| 1.2 EV71病毒粒子的结构特征 | 第14-15页 |
| 1.3 EV71病毒基因组的特征 | 第15页 |
| 1.4 EV71病毒非结构蛋白的结构生物学研究现状 | 第15-17页 |
| 1.5 2C蛋白的研究现状 | 第17-25页 |
| 1.5.1 N端结构域的功能 | 第18-20页 |
| 1.5.2 ATPase和Helicase结构域的功能 | 第20-21页 |
| 1.5.3 锌指结构域的功能 | 第21页 |
| 1.5.4 2C在病毒基因组复制过程中的作用 | 第21-23页 |
| 1.5.5 2C在病毒衣壳化过程中的作用 | 第23-24页 |
| 1.5.6 2C蛋白在拮抗天然免疫过程中的作用 | 第24页 |
| 1.5.7 2C蛋白抑制剂的研究现状 | 第24-25页 |
| 总结 | 第25-26页 |
| 本课题研究内容与意义 | 第26-27页 |
| 2. 实验材料 | 第27-31页 |
| 2.1 菌株及细胞株 | 第27页 |
| 2.2 RNA及ATP类似物 | 第27页 |
| 2.3 质粒 | 第27-29页 |
| 2.4 常用试剂和耗材 | 第29页 |
| 2.5 常用溶液 | 第29-30页 |
| 2.6 常用仪器和设备 | 第30-31页 |
| 3. 方法 | 第31-45页 |
| 3.1 2C蛋白的序列分析 | 第31页 |
| 3.2 质粒构建 | 第31-34页 |
| 3.3 蛋白表达与纯化 | 第34-37页 |
| 3.3.1 表达条件筛选 | 第34-35页 |
| 3.3.2 蛋白的表达与纯化 | 第35-36页 |
| 3.3.3 硒代蛋白表达纯化 | 第36-37页 |
| 3.4 晶体的初筛 | 第37-38页 |
| 3.5 晶体优化 | 第38-39页 |
| 3.6 目的蛋白的蛋白酶酶解试验 | 第39页 |
| 3.7 目的蛋白的甲基化处理 | 第39-40页 |
| 3.8 2C与ATP-γ-S复合物晶体的制备 | 第40页 |
| 3.9 晶体数据收集与结构解析 | 第40-41页 |
| 3.10 EV71 2C ATPase酶活性测定 | 第41-42页 |
| 3.11 小角散射Small-angle X ray scattering (SAXS) | 第42页 |
| 3.12 EV71重组病毒复制能力的检测 | 第42-45页 |
| 3.12.1 线性DNA模板的制备 | 第42-43页 |
| 3.12.2 感染性RNA的体外转录 | 第43页 |
| 3.12.3 重组病毒的包装 | 第43-44页 |
| 3.12.4 不同突变体包装活性的检测 | 第44-45页 |
| 4. 实验结果 | 第45-66页 |
| 4.1 2C蛋白的序列分析 | 第45-46页 |
| 4.2 蛋白表达与纯化 | 第46-48页 |
| 4.2.1 表达条件筛选 | 第46-47页 |
| 4.2.2 蛋白的纯化 | 第47-48页 |
| 4.3 蛋白酶酶解结果 | 第48-50页 |
| 4.4 EV71-2C 116-329硒代甲硫氨酸蛋白的制备 | 第50页 |
| 4.5 目的蛋白的甲基化 | 第50-52页 |
| 4.6 突变体蛋白的制备与结晶实验 | 第52-56页 |
| 4.7 结构与功能分析 | 第56-66页 |
| 4.7.1 EV71-2C 116-329结构的整体特征 | 第56-59页 |
| 4.7.2 EV71-2C 116-329蛋白的寡聚化 | 第59-62页 |
| 4.7.3 EV71-2C 116-329蛋白与ATP-γ-S复合物结构 | 第62-66页 |
| 5. 讨论 | 第66-71页 |
| 5.1 前体蛋白剪切和2C激活模型 | 第66-67页 |
| 5.2 2C蛋白的六聚体模型 | 第67-70页 |
| 5.3 2C蛋白结构对抑制剂设计的提示 | 第70-71页 |
| 第二部分: 冠状病毒HKU1 S蛋白受体结合区的结构与功能研究 | 第71-94页 |
| 摘要 | 第71页 |
| Abstract | 第71-72页 |
| 1. 前言 | 第72-74页 |
| 2. 材料与方法 | 第74-78页 |
| 2.1 细胞培养 | 第74页 |
| 2.2 克隆构建和突变体的设计 | 第74-75页 |
| 2.3 蛋白表达纯化 | 第75页 |
| 2.4 S蛋白的结构解析 | 第75-76页 |
| 2.5 ELISA | 第76页 |
| 2.6 HKU1S蛋白抑制病毒感染实验 | 第76页 |
| 2.7 荧光定量PCR检测HKU1 RNA | 第76-78页 |
| 3. 实验结果 | 第78-92页 |
| 3.1 S蛋白的结构域划分与序列比对 | 第78-79页 |
| 3.2 蛋白的纯化与结晶 | 第79-81页 |
| 3.3 S蛋白晶体结构分析 | 第81-84页 |
| 3.4 HKU1S蛋白三聚体的结构特点 | 第84-86页 |
| 3.5 HKU1S蛋白中和抗体识别表位的鉴定 | 第86-88页 |
| 3.6 受体结合相关氨基酸的鉴定 | 第88-90页 |
| 3.7 SD-1结构域功能的研究 | 第90-92页 |
| 4. 讨论 | 第92-94页 |
| 参考文献 | 第94-104页 |
| 附录 | 第104-106页 |
| 致谢 | 第106-107页 |
| 个人简历及发表文章 | 第107页 |
