| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-7页 |
| 第一章 绪论 | 第13-31页 |
| 1.1 甾体化合物 | 第13-16页 |
| 1.1.1 甾体化合物概述 | 第13-14页 |
| 1.1.2 甾体药物 | 第14-16页 |
| 1.2 甾体化合物的微生物转化 | 第16-18页 |
| 1.2.1 甾体化合物微生物转化的发展史 | 第16页 |
| 1.2.2 甾体化合物微生物转化的特点 | 第16-17页 |
| 1.2.3 甾体化合物微生物转化的类型 | 第17-18页 |
| 1.3 微生物降解甾醇侧链合成甾体药物中间体 | 第18-25页 |
| 1.3.1 甾体药物中间体 | 第18-19页 |
| 1.3.2 微生物甾醇侧链降解的原料来源 | 第19页 |
| 1.3.3 甾醇侧链降解微生物 | 第19-20页 |
| 1.3.4 微生物甾醇侧链降解的分子机制 | 第20-25页 |
| 1.4 甾醇微生物转化合成甾体药物中间体研究进展 | 第25-29页 |
| 1.4.1 甾体药物中间体产生菌的筛选和诱变选育 | 第25-27页 |
| 1.4.2 甾体微生物转化的新工艺 | 第27-28页 |
| 1.4.3 甾体微生物转化的代谢改造 | 第28-29页 |
| 1.5 研究意义和主要研究内容 | 第29-31页 |
| 1.5.1 研究意义 | 第29-30页 |
| 1.5.2 研究内容 | 第30-31页 |
| 第二章 诱变菌株M. neoaurum JC-12 高产ADD的分子机理解析 | 第31-47页 |
| 2.1 引言 | 第31-32页 |
| 2.2 实验材料 | 第32-34页 |
| 2.2.1 实验仪器 | 第32页 |
| 2.2.2 主要试剂与培养基 | 第32-33页 |
| 2.2.3 菌株、质粒和引物 | 第33-34页 |
| 2.3 实验方法 | 第34-38页 |
| 2.3.1 新金色分枝杆菌基因组DNA的提取 | 第34页 |
| 2.3.2 目的基因PCR反应扩增和产物回收 | 第34-35页 |
| 2.3.3 重组质粒的构建 | 第35页 |
| 2.3.4 感受态细胞的制备和转化 | 第35页 |
| 2.3.5 重组枯草芽孢杆菌的构建 | 第35页 |
| 2.3.6 重组枯草芽孢杆菌中KSDD的表达及纯化 | 第35-36页 |
| 2.3.7 重组枯草芽孢杆菌SDS-PAGE及蛋白浓度的测定 | 第36页 |
| 2.3.8 KSDD酶活力测定与动力学参数分析 | 第36页 |
| 2.3.9 新金色分枝杆菌中ksdd基因敲除和功能回补 | 第36-37页 |
| 2.3.10 AD和植物甾醇转化分析 | 第37页 |
| 2.3.11 分析方法 | 第37-38页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第38-46页 |
| 2.4.1 M.neoaurum ST-095 和M.neoaurum JC-12中ksdd的基因克隆及序列分析 | 第38页 |
| 2.4.2 枯草芽孢杆菌重组质粒pMA5-ksdd_Ⅰ和pMA5-ksdd_Ⅱ的构建与转化 | 第38-39页 |
| 2.4.3 重组菌B. subtilis 168/pMA5-ksdd_Ⅰ和B. subtilis 168/pMA5-ksdd_Ⅱ蛋白表达 | 第39-40页 |
| 2.4.4 氨基酸突变对KSDD活性的影响 | 第40-41页 |
| 2.4.5 氨基酸突变对KSDD催化AD合成ADD的影响 | 第41-42页 |
| 2.4.6 氨基酸突变对KSDD在植物甾醇转化过程中的影响 | 第42-43页 |
| 2.4.7 氨基酸突变影响KSDD活性的蛋白结构分析 | 第43-46页 |
| 2.5 本章小结 | 第46-47页 |
| 第三章 M. neoaurum JC-12 胆固醇氧化酶酶学性质及功能验证 | 第47-64页 |
| 3.1 引言 | 第47页 |
| 3.2 实验材料 | 第47-49页 |
| 3.2.1 实验仪器 | 第47-48页 |
| 3.2.2 主要试剂与培养基 | 第48页 |
| 3.2.3 菌株、质粒和引物 | 第48-49页 |
| 3.3 实验方法 | 第49-52页 |
| 3.3.1 新金色分枝杆菌基因组DNA的提取 | 第49页 |
| 3.3.2 目的基因PCR反应扩增和产物回收 | 第49页 |
| 3.3.3 重组质粒的构建 | 第49页 |
| 3.3.4 感受态细胞的制备和转化 | 第49页 |
| 3.3.5 重组菌的构建 | 第49-50页 |
| 3.3.6 重组菌中ChoM的表达及纯化 | 第50页 |
| 3.3.7 重组菌SDS-PAGE及蛋白浓度的测定 | 第50页 |
| 3.3.8 ChoM酶活力测定 | 第50页 |
| 3.3.9 重组ChoM酶学性质研究 | 第50-51页 |
| 3.3.10 重组枯草芽孢杆菌全细胞转化胆固醇合成 4-胆甾烯3酮 | 第51页 |
| 3.3.11 分析方法 | 第51-52页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第52-63页 |
| 3.4.1 M. neoaurum JC-12 中choM的基因克隆及序列分析 | 第52-53页 |
| 3.4.2 枯草芽孢杆菌重组质粒pMA5-choM1和pMA5-choM2的构建与转化 | 第53-54页 |
| 3.4.3 重组菌B. subtilis 168/pMA5-choM1和B. subtilis 168/pMA5-choM2蛋白表达 | 第54-55页 |
| 3.4.4 重组ChoM的蛋白纯化 | 第55页 |
| 3.4.5 重组ChoM的最适反应pH和pH稳定性 | 第55-56页 |
| 3.4.6 重组ChoM的最适反应温度和温度稳定性 | 第56-57页 |
| 3.4.7 金属离子和EDTA对重组ChoM的影响 | 第57页 |
| 3.4.8 重组ChoM的动力学分析 | 第57-58页 |
| 3.4.9 重组枯草芽孢杆菌转化胆固醇合成 4-胆甾烯3酮的研究 | 第58-60页 |
| 3.4.10 ChoM2在M. neoaurum JC-12 中的过量表达 | 第60-62页 |
| 3.4.11 ChoM2的过量表达对M. neoaurum JC-12 转化植物甾醇合成ADD的影响 | 第62-63页 |
| 3.5 本章小结 | 第63-64页 |
| 第四章 M. neoaurum JC-12 甾酮C27单加氧酶功能鉴定及应用 | 第64-82页 |
| 4.1 引言 | 第64页 |
| 4.2 实验材料 | 第64-67页 |
| 4.2.1 实验仪器 | 第64页 |
| 4.2.2 主要试剂与培养基 | 第64-65页 |
| 4.2.3 菌株、质粒和引物 | 第65-67页 |
| 4.3 实验方法 | 第67-70页 |
| 4.3.1 新金色分枝杆菌基因组DNA的提取 | 第67页 |
| 4.3.2 目的基因PCR反应扩增和产物回收 | 第67页 |
| 4.3.3 重组质粒的构建 | 第67页 |
| 4.3.4 感受态细胞的制备和转化 | 第67页 |
| 4.3.5 重组大肠杆菌的构建 | 第67-68页 |
| 4.3.6 重组大肠杆菌中SMO的表达及纯化 | 第68页 |
| 4.3.7 重组蛋白浓度测定及SDS-PAGE分析 | 第68页 |
| 4.3.8 SMO酶活力测定方法 | 第68页 |
| 4.3.9 重组SMO酶学性质研究 | 第68-69页 |
| 4.3.10 M. neoaurum ATCC 25795 中Smo基因的敲除和功能回补 | 第69页 |
| 4.3.11 Smo基因敲除菌株和功能回补菌株的表型差异分析 | 第69-70页 |
| 4.3.12 M. neoaurum JC-12 中SMO的过量表达 | 第70页 |
| 4.3.13 分析方法 | 第70页 |
| 4.4 实验结果与讨论 | 第70-81页 |
| 4.4.1 不同新金色分枝杆菌甾醇代谢分析 | 第70-71页 |
| 4.4.2 M. neoaurum中Smo的基因克隆及序列分析 | 第71-72页 |
| 4.4.3 重组菌E. coli BL21/p ET28a-Smo1 ， E.coli BL21/p ET28a-Smo2和E.coliBL21/pET28a-Smo3的蛋白表达与纯化 | 第72-73页 |
| 4.4.4 重组SMO的功能鉴定研究 | 第73-74页 |
| 4.4.5 重组SMO的酶学特性研究 | 第74-75页 |
| 4.4.6 M. neoaurum ATCC 25795 中SMO的基因敲除和功能回补 | 第75-77页 |
| 4.4.7 SMO的基因缺失对新金色分枝杆菌甾醇代谢的影响 | 第77-80页 |
| 4.4.8 SMO的过量表达对M. neoaurum JC-12 转化植物甾醇合成ADD的影响 | 第80-81页 |
| 4.5 本章小结 | 第81-82页 |
| 第五章 代谢工程改造M. neoaurum JC-12 合成甾体药物中间体ADD及其发酵工艺研究 | 第82-96页 |
| 5.1 引言 | 第82-83页 |
| 5.2 实验材料 | 第83-84页 |
| 5.2.1 实验仪器 | 第83页 |
| 5.2.2 主要试剂与培养基 | 第83页 |
| 5.2.3 菌株、质粒和引物 | 第83-84页 |
| 5.3 实验方法 | 第84-86页 |
| 5.3.1 新金色分枝杆菌基因组DNA的提取 | 第84-85页 |
| 5.3.2 目的基因PCR反应扩增和产物回收 | 第85页 |
| 5.3.3 重组质粒的构建 | 第85页 |
| 5.3.4 感受态细胞的制备和转化 | 第85页 |
| 5.3.5 M. neoaurum JC-12 中ksh A1基因敲除 | 第85页 |
| 5.3.6 重组新金色分枝杆菌JC-12_(S2-choM2-ksdd)的构建与表达 | 第85-86页 |
| 5.3.7 重组菌JC-12_(S2-choM2-ksdd)中相关酶活力测定 | 第86页 |
| 5.3.8 5-L发酵罐中重组菌JC-12_(S2-choM2-ksdd)转化植物甾醇放大研究 | 第86页 |
| 5.3.9 分析方法 | 第86页 |
| 5.4 实验结果与讨论 | 第86-95页 |
| 5.4.1 Ksh A1基因敲除菌株Mutksh A1的构建 | 第86-87页 |
| 5.4.2 KSH酶活性的缺失对植物甾醇转化的影响 | 第87-88页 |
| 5.4.3 菌株Mutksh A1中共表达ChoM2，SMO2和KSDD的菌种构建与表达 | 第88-90页 |
| 5.4.4 重组菌株JC-12_(S2-choM2-ksdd)对植物甾醇转化合成ADD的影响 | 第90-91页 |
| 5.4.5 不同碳源对重组菌株JC-12_(S2-choM2-ksdd)菌体生长的影响 | 第91-92页 |
| 5.4.6 多阶段发酵策略提高重组菌株JC-12_(S2-choM2-ksdd)合成ADD的能力 | 第92-95页 |
| 5.5 本章小结 | 第95-96页 |
| 第六章 新金色分枝杆菌转化植物甾醇合成睾酮的初探 | 第96-112页 |
| 6.1 引言 | 第96-97页 |
| 6.2 实验材料 | 第97-98页 |
| 6.2.1 实验仪器 | 第97页 |
| 6.2.2 主要试剂与培养基 | 第97页 |
| 6.2.3 菌株、质粒和引物 | 第97-98页 |
| 6.3 实验方法 | 第98-101页 |
| 6.3.1 17β-hsd3密码子优化及全基因合成 | 第98-99页 |
| 6.3.2 酵母基因组DNA的提取 | 第99页 |
| 6.3.3 目的基因PCR反应扩增和产物回收 | 第99页 |
| 6.3.4 重组质粒的构建 | 第99页 |
| 6.3.5 感受态细胞的制备和转化 | 第99页 |
| 6.3.6 重组毕赤酵母的构建与验证 | 第99页 |
| 6.3.7 重组毕赤酵母的诱导表达、纯化及酶学表征 | 第99-100页 |
| 6.3.8 17β-HSD3和G6PDH的酶活测定方法 | 第100页 |
| 6.3.9 胞内辅因子NADPH/NADP~+水平测定 | 第100页 |
| 6.3.10 重组P. pastoris/17β-HSD3~P-G6PDH全细胞转化AD合成TS的条件优化 | 第100页 |
| 6.3.11 重组M. neoaurum ZADF-4/17β-HSD3~M的构建及甾醇转化 | 第100-101页 |
| 6.3.12 分析方法 | 第101页 |
| 6.4 实验结果与讨论 | 第101-111页 |
| 6.4.1 重组毕赤酵母P. pastoris/17β-HSD3~P-G6PDH的构建 | 第101-102页 |
| 6.4.2 密码子优化提高 17β-HSD3在毕赤酵母中的表达 | 第102-103页 |
| 6.4.3 重组 17β-HSD3的纯化及酶学性质研究 | 第103-104页 |
| 6.4.4 17β-HSD3和G6PDH在毕赤酵母中功能性共表达 | 第104页 |
| 6.4.5 17β-HSD3和G6PDH共表达对重组毕赤酵母胞内NADPH/NADP~+含量及TS合成的影响 | 第104-105页 |
| 6.4.6 重组菌P. pastoris/17β-HSD3~P-G6PDH全细胞转化AD合成TS的条件优化 | 第105-108页 |
| 6.4.7 分批补料策略提高重组菌TS的产量 | 第108-109页 |
| 6.4.8 重组菌M. neoaurum ZADF-4/17β-HSD3~M转化植物甾醇合成TS的初探 | 第109-111页 |
| 6.5 本章小结 | 第111-112页 |
| 主要结论与展望 | 第112-115页 |
| 主要结论 | 第112-113页 |
| 课题展望 | 第113-115页 |
| 论文创新点 | 第115-116页 |
| 致谢 | 第116-118页 |
| 参考文献 | 第118-128页 |
| 附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第128-129页 |
