摘要 | 第6-8页 |
ABSTRACT | 第8-9页 |
第一章 研究背景及文献综述 | 第13-37页 |
1.1 基因靶向修饰 | 第13-14页 |
1.2 核酸酶技术的演化历程 | 第14-21页 |
1.2.1 锌指核酸酶 | 第14-15页 |
1.2.2 TALE核酸酶 | 第15-16页 |
1.2.3 CRISPR/Cas9核酸酶 | 第16-20页 |
1.2.5 Argonaut核酸酶 | 第20-21页 |
1.3 靶向核酸酶在畜牧业中的应用 | 第21-28页 |
1.3.1 靶向核酸酶在牛基因组功能研究中的应用 | 第21-22页 |
1.3.2 靶向核酸酶在羊基因组功能研究中的应用 | 第22-23页 |
1.3.3 靶向核酸酶在猪基因组功能研究中的应用 | 第23-26页 |
1.3.4 靶向核酸酶在鸡基因组功能研究中的应用 | 第26-27页 |
1.3.5 靶向核酸酶在家兔基因组功能研究中的应用 | 第27-28页 |
1.4 DNA损伤修复机制及偏好性概述 | 第28-30页 |
1.4.1 DNA损伤修复的类型 | 第28-29页 |
1.4.2 DNA损伤修复机制偏好性 | 第29-30页 |
1.5 核酸酶活性鉴定及阳性细胞富集方法概述 | 第30-35页 |
1.5.1 核酸酶活性鉴定方法概述 | 第30-33页 |
1.5.2 利用标记基因筛选富集阳性细胞 | 第33-35页 |
1.6 本研究目的意义 | 第35-37页 |
第二章 核酸酶的酵母系统活性验证 | 第37-54页 |
2.1 试验材料 | 第37-39页 |
2.1.1 菌株及质粒 | 第37-38页 |
2.1.2 试剂 | 第38页 |
2.1.3 引物 | 第38-39页 |
2.2 试验方法 | 第39-44页 |
2.2.1 报告系统的建立 | 第39-42页 |
2.2.2 锌指核酸酶载体的构建 | 第42页 |
2.2.3 锌指核酸酶活性验证 | 第42-43页 |
2.2.4 酵母报告载体系统的优化 | 第43-44页 |
2.3 试验结果 | 第44-51页 |
2.3.1 酵母报告系统的构建 | 第44-45页 |
2.3.2 锌指核酸酶酵母表达载体的构建 | 第45-46页 |
2.3.3 锌指核酸酶活性验证 | 第46-47页 |
2.3.4 酵母报告载体系统的优化 | 第47-51页 |
2.4 讨论 | 第51-53页 |
2.5 小结 | 第53-54页 |
第三章 核酸酶的哺乳动物细胞活性验证及富集系统的建立 | 第54-67页 |
3.1 试验材料 | 第55-56页 |
3.1.1 细胞株及质粒 | 第55页 |
3.1.2 试剂 | 第55页 |
3.1.3 试剂和培养基配制 | 第55-56页 |
3.1.4 引物和序列 | 第56页 |
3.2 试验方法 | 第56-62页 |
3.2.1 真核细胞报告系统的构建 | 第56-60页 |
3.2.2 CRISPR/StCas9真核表达载体的构建 | 第60-61页 |
3.2.3 锌指核酸酶真核表达载体的构建 | 第61页 |
3.2.4 细胞培养 | 第61页 |
3.2.5 细胞转染 | 第61-62页 |
3.2.6 流式细胞仪检测 293T细胞中报告载体的修复效率 | 第62页 |
3.2.7 Puromycin筛选抗性细胞 | 第62页 |
3.3 试验结果 | 第62-65页 |
3.3.1 StCas9切割产生DSB后NHEJ和SSA修复机制的效率比较 | 第62-63页 |
3.3.2 ZFNs切割产生DSB后NHEJ和SSA修复机制的效率比较 | 第63-64页 |
3.3.3 NHEJ-RPG和SSA-RPG报告载体灵敏度比较 | 第64-65页 |
3.4 讨论 | 第65-66页 |
3.5 小结 | 第66-67页 |
第四章 核酸酶修饰后阳性细胞的富集 | 第67-79页 |
4.1 试验材料 | 第68页 |
4.1.1 细胞株、质粒及试剂 | 第68页 |
4.1.2 引物 | 第68页 |
4.2 试验方法 | 第68-70页 |
4.2.1 表达载体和报告载体的构建 | 第68页 |
4.2.2 流式细胞仪分选富集阳性细胞 | 第68-69页 |
4.2.3 puromycin筛选抗性细胞 | 第69页 |
4.2.4 T7E1检测细胞基因组中的基因突变效率 | 第69页 |
4.2.5 T-A克隆测序检测基因组中的突变 | 第69-70页 |
4.3 试验结果 | 第70-76页 |
4.3.1 核酸酶作用于基因组活性检测 | 第70页 |
4.3.2 NHEJ-RPG和SSA-RPG报告载体富集效果比较 | 第70-71页 |
4.3.3 puromycin筛选富集核酸酶处理后的基因突变阳性细胞 | 第71-73页 |
4.3.4 流式分选富集核酸酶处理后的基因突变阳性细胞 | 第73-74页 |
4.3.5 puromycin富集对脱靶效应的影响 | 第74-76页 |
4.4 讨论 | 第76-77页 |
4.5 小结 | 第77-79页 |
第五章 FOKI突变体的位点特异性突变 | 第79-85页 |
5.1 试验材料 | 第79-80页 |
5.1.1 细胞株及质粒 | 第79-80页 |
5.1.2 试剂 | 第80页 |
5.1.3 引物 | 第80页 |
5.2 试验方法 | 第80-82页 |
5.2.1 FokI核酸内切酶的多位点突变 | 第80-82页 |
5.3 试验结果 | 第82-84页 |
5.3.1 FokI核酸内切酶的多位点突变 | 第82-83页 |
5.3.2 包含FokI突变体的CCR5 ZFN酵母表达载体构建 | 第83-84页 |
5.4 讨论 | 第84页 |
5.5 小节 | 第84-85页 |
结论与创新点 | 第85-86页 |
缩略 词 | 第86-88页 |
参考文献 | 第88-107页 |
致谢 | 第107-109页 |
作者简介 | 第109-110页 |