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人工靶向核酸酶活性鉴定及阳性编辑细胞富集系统优化研究

摘要第6-8页
ABSTRACT第8-9页
第一章 研究背景及文献综述第13-37页
    1.1 基因靶向修饰第13-14页
    1.2 核酸酶技术的演化历程第14-21页
        1.2.1 锌指核酸酶第14-15页
        1.2.2 TALE核酸酶第15-16页
        1.2.3 CRISPR/Cas9核酸酶第16-20页
        1.2.5 Argonaut核酸酶第20-21页
    1.3 靶向核酸酶在畜牧业中的应用第21-28页
        1.3.1 靶向核酸酶在牛基因组功能研究中的应用第21-22页
        1.3.2 靶向核酸酶在羊基因组功能研究中的应用第22-23页
        1.3.3 靶向核酸酶在猪基因组功能研究中的应用第23-26页
        1.3.4 靶向核酸酶在鸡基因组功能研究中的应用第26-27页
        1.3.5 靶向核酸酶在家兔基因组功能研究中的应用第27-28页
    1.4 DNA损伤修复机制及偏好性概述第28-30页
        1.4.1 DNA损伤修复的类型第28-29页
        1.4.2 DNA损伤修复机制偏好性第29-30页
    1.5 核酸酶活性鉴定及阳性细胞富集方法概述第30-35页
        1.5.1 核酸酶活性鉴定方法概述第30-33页
        1.5.2 利用标记基因筛选富集阳性细胞第33-35页
    1.6 本研究目的意义第35-37页
第二章 核酸酶的酵母系统活性验证第37-54页
    2.1 试验材料第37-39页
        2.1.1 菌株及质粒第37-38页
        2.1.2 试剂第38页
        2.1.3 引物第38-39页
    2.2 试验方法第39-44页
        2.2.1 报告系统的建立第39-42页
        2.2.2 锌指核酸酶载体的构建第42页
        2.2.3 锌指核酸酶活性验证第42-43页
        2.2.4 酵母报告载体系统的优化第43-44页
    2.3 试验结果第44-51页
        2.3.1 酵母报告系统的构建第44-45页
        2.3.2 锌指核酸酶酵母表达载体的构建第45-46页
        2.3.3 锌指核酸酶活性验证第46-47页
        2.3.4 酵母报告载体系统的优化第47-51页
    2.4 讨论第51-53页
    2.5 小结第53-54页
第三章 核酸酶的哺乳动物细胞活性验证及富集系统的建立第54-67页
    3.1 试验材料第55-56页
        3.1.1 细胞株及质粒第55页
        3.1.2 试剂第55页
        3.1.3 试剂和培养基配制第55-56页
        3.1.4 引物和序列第56页
    3.2 试验方法第56-62页
        3.2.1 真核细胞报告系统的构建第56-60页
        3.2.2 CRISPR/StCas9真核表达载体的构建第60-61页
        3.2.3 锌指核酸酶真核表达载体的构建第61页
        3.2.4 细胞培养第61页
        3.2.5 细胞转染第61-62页
        3.2.6 流式细胞仪检测 293T细胞中报告载体的修复效率第62页
        3.2.7 Puromycin筛选抗性细胞第62页
    3.3 试验结果第62-65页
        3.3.1 StCas9切割产生DSB后NHEJ和SSA修复机制的效率比较第62-63页
        3.3.2 ZFNs切割产生DSB后NHEJ和SSA修复机制的效率比较第63-64页
        3.3.3 NHEJ-RPG和SSA-RPG报告载体灵敏度比较第64-65页
    3.4 讨论第65-66页
    3.5 小结第66-67页
第四章 核酸酶修饰后阳性细胞的富集第67-79页
    4.1 试验材料第68页
        4.1.1 细胞株、质粒及试剂第68页
        4.1.2 引物第68页
    4.2 试验方法第68-70页
        4.2.1 表达载体和报告载体的构建第68页
        4.2.2 流式细胞仪分选富集阳性细胞第68-69页
        4.2.3 puromycin筛选抗性细胞第69页
        4.2.4 T7E1检测细胞基因组中的基因突变效率第69页
        4.2.5 T-A克隆测序检测基因组中的突变第69-70页
    4.3 试验结果第70-76页
        4.3.1 核酸酶作用于基因组活性检测第70页
        4.3.2 NHEJ-RPG和SSA-RPG报告载体富集效果比较第70-71页
        4.3.3 puromycin筛选富集核酸酶处理后的基因突变阳性细胞第71-73页
        4.3.4 流式分选富集核酸酶处理后的基因突变阳性细胞第73-74页
        4.3.5 puromycin富集对脱靶效应的影响第74-76页
    4.4 讨论第76-77页
    4.5 小结第77-79页
第五章 FOKI突变体的位点特异性突变第79-85页
    5.1 试验材料第79-80页
        5.1.1 细胞株及质粒第79-80页
        5.1.2 试剂第80页
        5.1.3 引物第80页
    5.2 试验方法第80-82页
        5.2.1 FokI核酸内切酶的多位点突变第80-82页
    5.3 试验结果第82-84页
        5.3.1 FokI核酸内切酶的多位点突变第82-83页
        5.3.2 包含FokI突变体的CCR5 ZFN酵母表达载体构建第83-84页
    5.4 讨论第84页
    5.5 小节第84-85页
结论与创新点第85-86页
缩略 词第86-88页
参考文献第88-107页
致谢第107-109页
作者简介第109-110页

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