| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 目录 | 第5-8页 |
| 第一章 绪论 | 第8-16页 |
| ·K5 多糖研究背景 | 第8-11页 |
| ·K5 多糖简介 | 第8页 |
| ·K5 多糖理化性质 | 第8-9页 |
| ·类肝素多糖的研究 | 第9-11页 |
| ·K5 多糖合成过程 | 第11-12页 |
| ·K5 多糖的发酵生产概况 | 第12页 |
| ·K5 裂解酶研究进展 | 第12-13页 |
| ·肝素分子量对药理活性的影响 | 第12页 |
| ·K5 裂解酶的性质和研究概况 | 第12-13页 |
| ·大肠杆菌基因敲除系统 | 第13-14页 |
| ·立题意义 | 第14页 |
| ·研究内容 | 第14-16页 |
| 第二章 大肠杆菌 K5 多糖的发酵工艺优化 | 第16-34页 |
| ·材料与方法 | 第16-23页 |
| ·材料 | 第16-17页 |
| ·培养基与培养条件 | 第16页 |
| ·主要试剂 | 第16页 |
| ·主要仪器 | 第16-17页 |
| ·实验方法 | 第17-23页 |
| ·间羟基联苯法测 K5 多糖含量 | 第17页 |
| ·种子培养基发酵优化 | 第17-19页 |
| ·K5 多糖发酵工艺优化 | 第19-21页 |
| ·K5 多糖摇瓶发酵过程曲线 | 第21-22页 |
| ·K5 多糖 5L 发酵罐发酵过程曲线 | 第22页 |
| ·K5 多糖分离纯化 | 第22页 |
| ·K5 多糖分子量分析 | 第22-23页 |
| ·结果与讨论 | 第23-32页 |
| ·种子培养基优化 | 第23-25页 |
| ·氮源碳源种类选择 | 第23页 |
| ·碳源和碳源浓度的选择 | 第23-24页 |
| ·金属离子浓度对 K5 多糖发酵的影响 | 第24页 |
| ·种子生长过程曲线 | 第24-25页 |
| ·发酵培养基优化 | 第25-29页 |
| ·氮源碳源种类的选择 | 第25-26页 |
| ·发酵培养基 Plackett-Burman 实验设计及实验结果分析 | 第26页 |
| ·单因素实验 | 第26-27页 |
| ·正交试验结果及数据分析 | 第27-28页 |
| ·装液量对 K5 多糖发酵的影响 | 第28-29页 |
| ·大肠杆菌 K5 多糖摇瓶发酵过程曲线 | 第29页 |
| ·大肠杆菌 K5 多糖 5L 发酵罐发酵过程曲线 | 第29-30页 |
| ·大肠杆菌 K5 多糖分离纯化 | 第30页 |
| ·大肠杆菌 K5 多糖发酵过程分子量分析 | 第30-32页 |
| ·本章小结 | 第32-34页 |
| 第三章 K5 裂解酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质分析 | 第34-46页 |
| ·材料与方法 | 第34-39页 |
| ·材料 | 第34-36页 |
| ·菌株与质粒 | 第34页 |
| ·工具酶以及主要试剂 | 第34-35页 |
| ·培养基和培养条件 | 第35页 |
| ·主要仪器 | 第35-36页 |
| ·实验方法 | 第36-39页 |
| ·大肠杆菌 K5 基因组的提取 | 第36页 |
| ·K5 裂解酶(Elma)基因的扩增 | 第36页 |
| ·Elma 基因胶回收 | 第36页 |
| ·Elma 基因连接 T 载体并转化入大肠杆菌 JM 109 中 | 第36-37页 |
| ·Elma 基因连接 pET-28a 并转化入大肠杆菌 BL21 中 | 第37页 |
| ·重组 K5 多糖裂解酶-Elma 的诱导表达 | 第37页 |
| ·重组 K5 多糖裂解酶-Elma 的 Ni 柱分离纯化 | 第37-38页 |
| ·重组 K5 多糖裂解酶-Elma 的 G-75 凝胶柱分离纯化 | 第38页 |
| ·Elma 的活性定性检测 | 第38页 |
| ·PAGE 多糖凝胶电泳步骤 | 第38页 |
| ·重组 Elma 的酶活测定（优化温度和优化 pH) | 第38-39页 |
| ·结果与讨论 | 第39-43页 |
| ·目的基因-elma 的扩增 | 第39页 |
| ·表达载体 pET-28a(+)- Elma 的构建 | 第39-40页 |
| ·重组蛋白 Elma 在大肠杆菌 BL21(DE3)中的表达及条件优化 | 第40页 |
| ·重组蛋白 ElmaNi2+-NTA 亲和层析及 G-75 凝胶层析纯化 | 第40-41页 |
| ·Elma 的活性定性检测 | 第41页 |
| ·Elma 的反应优化的温度和 PH | 第41-42页 |
| ·Elma 的反底物特异性分析 | 第42-43页 |
| ·本章小结 | 第43-46页 |
| 第四章 K5 裂解酶的基因敲除 | 第46-52页 |
| ·材料与方法 | 第46-49页 |
| ·菌株和质粒 | 第46页 |
| ·培养基 | 第46页 |
| ·试剂 | 第46页 |
| ·酶 | 第46-47页 |
| ·实验方法 | 第47-49页 |
| ·大肠杆菌 K5 感受态制备 | 第47页 |
| ·K5 裂解酶基因敲除 Helper 质粒-pKD46 电转化 | 第47页 |
| ·基因敲除同源重组片段的 PCR 扩增 | 第47-48页 |
| ·大肠杆菌裂解酶基因诱导敲除 | 第48页 |
| ·大肠杆菌裂解酶基因敲除菌株 PCR 验证 | 第48页 |
| ·大肠杆菌裂解酶基因敲除前后 K5 裂解酶酶活测定 | 第48-49页 |
| ·结果与讨论 | 第49-50页 |
| ·pKD46 电转化入大肠杆菌 K5 | 第49页 |
| ·敲除基因片段 PCR 结果，同源片段的大小为 1133 bp | 第49-50页 |
| ·敲除基因片段 PCR 验证 | 第50页 |
| ·原始菌与Δ K5lyase 菌株酶活比较 | 第50页 |
| ·本章小结 | 第50-52页 |
| 第五章 结论与展望 | 第52-54页 |
| 致谢 | 第54-55页 |
| 参考文献 | 第55-58页 |
| 附录 | 第58-59页 |
