| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-18页 |
| 前言 | 第18-19页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-54页 |
| 第一节 小反刍兽疫及其分子流行病学研究进展 | 第19-31页 |
| 1 临床症状 | 第19页 |
| 2 病理变化 | 第19-23页 |
| 3 病原学 | 第23-26页 |
| 4 PPR病毒全基因序列及其基因变异特性 | 第26-31页 |
| 第二节 小反刍兽疫免疫学诊断方法及疫苗免疫研究进展 | 第31-43页 |
| 1 病毒蛋白 | 第31-33页 |
| 2 病原诊断技术 | 第33-37页 |
| 3 血清学诊断技术 | 第37-40页 |
| 4 疫苗的研制 | 第40-43页 |
| 第三节 小反刍兽疫(PPR)传入我国的风险分析 | 第43-53页 |
| 1 地理分布 | 第43页 |
| 2 小反刍兽疫的传播途径 | 第43页 |
| 3 小反刍兽疫易感动物 | 第43-46页 |
| 4 小反刍兽疫对我国的危害确认 | 第46-47页 |
| 5 小反刍兽疫传入我国的途径及各途径的风险分析 | 第47-49页 |
| 6 小反刍兽疫传入我国的风险控制 | 第49-50页 |
| 7 我国防控小反刍兽疫存在的问题 | 第50-51页 |
| 8 我国防止PPR应采取的措施 | 第51-53页 |
| 第四节 本研究的目的和意义 | 第53-54页 |
| 第二章 PPRV N基因的合成与表达 | 第54-70页 |
| 1 材料与方法 | 第55-64页 |
| ·主要仪器设备 | 第55页 |
| ·菌种、载体 | 第55页 |
| ·主要试剂 | 第55页 |
| ·pET-32H质粒 | 第55页 |
| ·PPRV N基因的合成 | 第55-56页 |
| ·引物合成 | 第56-57页 |
| ·大肠杆菌JM109的培养 | 第57页 |
| ·PUC-PPRV-N质粒的提取(碱裂解法) | 第57-58页 |
| ·PUC-PPRV-N质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定 | 第58-59页 |
| ·PUC-PPRV-N大肠杆菌JM109和质粒的PCR鉴定 | 第59页 |
| ·PPRV-N基因的大量扩增 | 第59页 |
| ·小量胶回收试剂盒法回收PCR产物PPRV-N基因 | 第59-60页 |
| ·pET32-H质粒的提取与电泳鉴定 | 第60页 |
| ·pET32-H质粒和PCR产物的双酶切及回收 | 第60-61页 |
| ·PPRV-N基因和pET32-H质粒大片断的连接 | 第61页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第61-62页 |
| ·pET32-H连接产物的转化 | 第62页 |
| ·大肠杆菌pET32-PPRV-N DH5 α 的培养 | 第62页 |
| ·pET32-PPRV-N质粒的提取 | 第62页 |
| ·重组质粒pET32-PPRV-N的鉴定 | 第62-63页 |
| ·PPRV-N基因的诱导表达 | 第63页 |
| ·重组质粒表达产物的SDS-PAGE鉴定 | 第63页 |
| ·Western-blotting检测鉴定 | 第63-64页 |
| 2 结果 | 第64-68页 |
| ·PPRV N基因的合成 | 第64-65页 |
| ·PUC-PPRV-N质粒的的琼脂糖凝胶电泳鉴定 | 第65页 |
| ·PUC-PPRV-N大肠杆菌JM109和质粒的PCR鉴定 | 第65页 |
| ·pET32-H质粒电泳鉴定结果 | 第65页 |
| ·重组质粒pET32-PPRV-N的鉴定 | 第65-66页 |
| ·重组质粒表达产物的SDS-PAGE鉴定 | 第66-67页 |
| ·Western-blotting检测鉴定 | 第67-68页 |
| 3 讨论 | 第68-69页 |
| ·我国建立PPRV诊断方法的必要性 | 第68页 |
| ·PPRV诊断试剂及PPRV N蛋白的选择 | 第68页 |
| ·PPRV N基因的合成 | 第68-69页 |
| 4 小结 | 第69-70页 |
| ·PPRV N基因的合成 | 第69页 |
| ·重组质粒pET32-PPRV-N的构建 | 第69页 |
| ·PPRV N蛋白的表达与鉴定 | 第69-70页 |
| 第三章 小反刍兽疫间接ELISA方法的建立 | 第70-87页 |
| 1 材料与方法 | 第71-77页 |
| ·试验材料 | 第71页 |
| ·诱导表达条件的优化 | 第71页 |
| ·表达产物可溶性处理方法的选择 | 第71-72页 |
| ·pET-PPRV-N蛋白表达产物的纯化 | 第72-74页 |
| ·参考阴性血清的制备 | 第74页 |
| ·参考阳性血清的制备 | 第74-75页 |
| ·间接ELISA方法的建立 | 第75-77页 |
| 2 结果 | 第77-83页 |
| ·pET32-PPRV-N诱导表达条件的优化结果 | 第77-78页 |
| ·表达产物可溶性处理方法的选择 | 第78页 |
| ·纯化方案的选择结果 | 第78-79页 |
| ·蛋白的浓缩与除盐 | 第79-80页 |
| ·参考阳性血清制造结果 | 第80页 |
| ·间接ELISA方法的建立 | 第80-82页 |
| ·ELISA方法临界点的确定 | 第82页 |
| ·间接ELISA的特异性试验结果 | 第82页 |
| ·间接ELISA的敏感性与特异性确定结果 | 第82-83页 |
| ·重复性试验 | 第83页 |
| 3 讨论 | 第83-85页 |
| ·PPRV N蛋白的纯化 | 第83页 |
| ·PPRV阳性血清的制备 | 第83-84页 |
| ·I-ELISA底物的选择 | 第84页 |
| ·I-ELISA临界点的确定 | 第84页 |
| ·与C-ELISA的比较 | 第84-85页 |
| ·PPRV N蛋白胶体金试纸条方法的尝试 | 第85页 |
| 4 小结 | 第85-87页 |
| ·PPRV N蛋白的表达与纯化 | 第85页 |
| ·PPRV N蛋白I-ELISA方法的建立 | 第85-86页 |
| ·PPRV I-ELISA与C-ELISA的比较 | 第86-87页 |
| 第四章 PPRV N基因RT-PCR检测方法的建立 | 第87-99页 |
| 1 材料与方法 | 第88-93页 |
| ·菌种、细胞与载体 | 第88页 |
| ·引物合成 | 第88页 |
| ·大肠杆菌JM109的培养 | 第88页 |
| ·PUC-PPRV-N质粒的提取 | 第88页 |
| ·PPRV-N基因的大量扩增 | 第88-89页 |
| ·小量胶回收试剂盒法回收PCR产物PPRV-N基因 | 第89页 |
| ·pGEM-T载体与PPRV-N基因的连接反应 | 第89页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第89页 |
| ·pGEM-T连接产物的转化 | 第89-90页 |
| ·pGEM-T-PPRV-N质粒的提取 | 第90页 |
| ·pGEM-T-PPRV-N大肠杆菌和质粒的PCR鉴定 | 第90页 |
| ·pGEM-T-PPRV-N质粒的线性化处理 | 第90-91页 |
| ·线性化质粒的纯化 | 第91页 |
| ·线性化质粒浓度的测定 | 第91页 |
| ·体外转录 | 第91页 |
| ·转录产物的纯化 | 第91-92页 |
| ·转录产物浓度的测定 | 第92页 |
| ·模板RNA标准品的制备 | 第92页 |
| ·RT-PCR条件的优化 | 第92页 |
| ·RT-PCR特异性试验 | 第92-93页 |
| ·RT-PCR敏感性测定 | 第93页 |
| 2 结果 | 第93-96页 |
| ·PPRV-N基因的大量扩增及小量胶回收结果 | 第93页 |
| ·pGEM-T-PPRV-N大肠杆菌和质粒的PCR鉴定 | 第93页 |
| ·pGEM-T-PPRV-N质粒的线性化处理 | 第93-94页 |
| ·线性化质粒浓度的测定 | 第94页 |
| ·转录产物浓度的测定 | 第94-95页 |
| ·模板RNA标准品的制备 | 第95页 |
| ·RT-PCR条件的优化 | 第95页 |
| ·RT-PCR特异性试验 | 第95页 |
| ·RT-PCR敏感性测定 | 第95-96页 |
| 3 讨论 | 第96-97页 |
| ·引物的选择 | 第96-97页 |
| ·RNA阳性对照的制备 | 第97页 |
| ·RT-PCR的特异性 | 第97页 |
| 4 小结 | 第97-99页 |
| ·RT-PCR阳性对照的制备 | 第97-98页 |
| ·RT-PCR程序的建立 | 第98-99页 |
| 结论 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-108页 |
| 附录 | 第108-116页 |
| 附1 N基因片断的18株PPRV的基本信息 | 第108页 |
| 附2 SDS-PAGE蛋白电泳所用试剂的配制 | 第108-110页 |
| 附3 几株PPRV的N蛋白全氨基酸序列变异情况 | 第110-113页 |
| 附4 PPRV H蛋白竞争ELISA的操作 | 第113-115页 |
| 附5 RNA模板拷贝数计算方法 | 第115-116页 |
| 致谢 | 第116-117页 |
| 作者简介 | 第117页 |
