| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 1 引言 | 第11-14页 |
| 2 材料和方法 | 第14-35页 |
| ·试验材料 | 第14-17页 |
| ·菌株和质粒 | 第14页 |
| ·主要试剂 | 第14页 |
| ·供试培养基及试剂配制 | 第14-16页 |
| ·主要仪器 | 第16-17页 |
| ·玉米大斑病菌STK2 基因侧翼序列的获得 | 第17-21页 |
| ·玉米大斑病菌基因组DNA 的提取 | 第17页 |
| ·模板DNA 的制备和引物的设计 | 第17-18页 |
| ·Genome walking PCR 扩增 | 第18-19页 |
| ·DNA 片段的纯化 | 第19页 |
| ·PCR 产物与pMD18-T 载体的连接 | 第19页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第19-20页 |
| ·连接产物转化感受态细胞 | 第20页 |
| ·PCR 验证阳性克隆 | 第20页 |
| ·碱裂解法小量提取质粒 | 第20-21页 |
| ·质粒样本测序分析 | 第21页 |
| ·基因的拼结及结构预测分析 | 第21页 |
| ·STK2 基因编码蛋白的结构预测分析 | 第21页 |
| ·STK2 基因敲除转化子的获得 | 第21-26页 |
| ·STK2 同源重组载体的构建 | 第21-23页 |
| ·重组基因片段的制备 | 第23页 |
| ·原生质体的制备 | 第23-24页 |
| ·原生质体的纯化 | 第24页 |
| ·原生质体的活力测定及释放方式观察 | 第24页 |
| ·原生质体转化 | 第24页 |
| ·原生质体的再生 | 第24页 |
| ·转化子的筛选 | 第24-25页 |
| ·转化子基因组DNA 的提取 | 第25页 |
| ·转化子的PCR 筛选 | 第25-26页 |
| ·STK2 基因敲除转化子的Southern 验证 | 第26-27页 |
| ·探针制备 | 第26页 |
| ·限制性内切酶酶切基因组 | 第26页 |
| ·电转移 | 第26页 |
| ·Southern Blot | 第26-27页 |
| ·免疫检测 | 第27页 |
| ·玉米大斑病菌STK2 基因敲除突变体Δstk2 的生物学性状分析 | 第27-29页 |
| ·Δstk2 突变菌株菌落形态的观察、菌丝形态的显微观察和菌落生长速度 测定 | 第27页 |
| ·Δstk2 突变菌株产毒力的测定 | 第27-28页 |
| ·Δstk2 突变菌株致病力测定 | 第28页 |
| ·Δstk2 突变菌株的组织病理学观察 | 第28页 |
| ·Δstk2 突变体菌株的漆酶活性检测 | 第28页 |
| ·Δstk2 突变菌株高渗条件下菌丝形态的显微观察 | 第28-29页 |
| ·STK2 基因在毕赤酵母中的表达 | 第29-33页 |
| ·病菌基因组RNA 的提取 | 第29页 |
| ·反转录体系及第一链cDNA 的合成 | 第29-30页 |
| ·真核表达载体的构建 | 第30页 |
| ·重组质粒的线性化 | 第30-31页 |
| ·电击法转化毕赤酵母 | 第31页 |
| ·PEG 介导法转化毕赤酵母 | 第31页 |
| ·筛选G418 抗性菌株 | 第31-32页 |
| ·PCR 法验证重组转化子 | 第32页 |
| ·重组基因在酵母中的小量诱导表达 | 第32页 |
| ·浓缩沉淀蛋白质 | 第32-33页 |
| ·SDS-PAGE | 第33页 |
| ·玉米大斑病菌STKK2 基因片段的克隆 | 第33-34页 |
| ·引物设计 | 第33页 |
| ·STKK2 同源片段的扩增 | 第33页 |
| ·STKK2 同源片段的延伸 | 第33-34页 |
| ·扩增产物的克隆、测序、同源性分析 | 第34页 |
| ·玉米大斑病菌STKK2 基因片段的生物信息学分析 | 第34页 |
| ·玉米大斑病菌STKKK2 基因的拷贝数分析 | 第34-35页 |
| ·探针制备 | 第34页 |
| ·基因组酶切 | 第34页 |
| ·转膜、杂交、免疫检测 | 第34-35页 |
| 3 结果与分析 | 第35-71页 |
| ·STK2 基因侧翼序列的获得 | 第35-38页 |
| ·STK2 基因启动子区分析 | 第38-42页 |
| ·CpG 岛预测 | 第40页 |
| ·内含子/外显子剪切位点识别 | 第40-42页 |
| ·STK2 基因编码蛋白质的一级结构分析 | 第42-44页 |
| ·蛋白质理化性质分析 | 第42页 |
| ·STK2 基因的信号肽预测 | 第42-43页 |
| ·STK2 基因跨膜结构域的预测 | 第43页 |
| ·玉米大斑病菌STK2 基因编码氨基酸序列疏水性/亲水性分析 | 第43-44页 |
| ·玉米大斑病菌STK2 基因编码氨基酸序列的磷酸化位点分析 | 第44页 |
| ·STK2 基因编码蛋白质的二级结构分析 | 第44-45页 |
| ·STK2 基因编码蛋白质的保守结构域分析 | 第45-46页 |
| ·STK2 基因编码蛋白质的三级结构分析 | 第46-49页 |
| ·STK2 基因编码蛋白质同源性分析 | 第49页 |
| ·STK2 的同源重组 | 第49-60页 |
| ·STK2 基因同源重组载体构建及验证 | 第49-51页 |
| ·重组DNA 片段的PCR 扩增 | 第51-52页 |
| ·玉米大斑病菌原生质体活力的测定 | 第52页 |
| ·原生质体的释放方式的观察 | 第52-53页 |
| ·玉米大斑病菌对潮霉素敏感性测定 | 第53-54页 |
| ·STK2 基因同源重组载体转化 | 第54页 |
| ·STK2 基因同源重组转化子筛选与鉴定 | 第54-55页 |
| ·Δstk2 突变菌株性状观察 | 第55-56页 |
| ·Δstk2 突变菌株的生长速度确定 | 第56-57页 |
| ·Δstk2 突变菌株的组织病理学试验 | 第57-58页 |
| ·Δstk2 突变菌株在洋葱表皮上附着胞诱导 | 第58页 |
| ·Δstk2 突变菌株粗毒素生物学活性的测定 | 第58-59页 |
| ·Δstk2 突变菌株的致病力 | 第59页 |
| ·Δstk2 突变体菌株高渗胁迫下的生长形态 | 第59-60页 |
| ·STK2 基因在毕赤酵母中的表达 | 第60-64页 |
| ·真核表达载体的构建 | 第60-61页 |
| ·MD 筛选转化子 | 第61页 |
| ·YPD-G418 筛选高拷贝转化子 | 第61-62页 |
| ·PCR 鉴定重组转化子 | 第62页 |
| ·SDS-PAGE 电泳 | 第62-64页 |
| ·STKK2 基因片段的克隆及生物信息学的初步分析 | 第64-71页 |
| ·STKK2 基因同源片段的获得 | 第64-65页 |
| ·STKK2 基因同源片段的延伸 | 第65-67页 |
| ·STKK2 基因的ORF 预测 | 第67-68页 |
| ·STKK2 基因转录终止信号预测分析 | 第68页 |
| ·STKK2 基因保守结构域分析 | 第68-69页 |
| ·STKK2 基因编码蛋白质的三级结构分析 | 第69页 |
| ·STKK2 基因的同源进化分析 | 第69-70页 |
| ·Southern blot 验证STKK2 基因的拷贝数 | 第70-71页 |
| 4 讨论 | 第71-74页 |
| ·原生质体转化技术 | 第71页 |
| ·Genome walking 技术获得已知基因片段的侧翼序列 | 第71-72页 |
| ·STK2 基因在酵母中的表达 | 第72-73页 |
| ·STK2 基因敲除突变体的研究 | 第73-74页 |
| 5 结论 | 第74-75页 |
| 参考文献 | 第75-81页 |
| 在读期间发表的学术论文 | 第81-82页 |
| 作者简历 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83页 |
