| 缩写词表 | 第1-8页 |
| 摘要 | 第8-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 第一章 前言 | 第11-26页 |
| 一. 启动子概述 | 第11-22页 |
| 1. 启动子的概念及特征 | 第11页 |
| 2. 启动子的结构 | 第11-13页 |
| ·原核生物启动子的结构模型 | 第11-12页 |
| ·真核生物启动子的结构模型 | 第12-13页 |
| 3. 启动子分类 | 第13-15页 |
| ·组成型启动子 | 第13-14页 |
| ·组织特异性启动子 | 第14页 |
| ·诱导型启动子 | 第14-15页 |
| 4. 基因启动子克隆方法 | 第15-21页 |
| ·启动子预测 | 第15页 |
| ·通过构建基因组文库克隆启动子 | 第15-16页 |
| ·利用启动子探针载体筛选启动子 | 第16-17页 |
| ·利用PCR技术克隆启动子 | 第17-20页 |
| ·常规PCR技术 | 第17页 |
| ·环状PCR技术 | 第17-19页 |
| ·接头PCR技术 | 第19页 |
| ·TAIL-PCR | 第19-20页 |
| ·利用启动子陷阱技术克隆启动子 | 第20-21页 |
| 5. 启动子研究意义与展望 | 第21-22页 |
| 二. 低温微生物概述 | 第22-23页 |
| 1. 低温微生物概念 | 第22页 |
| 2. 低温微生物冷适应机制 | 第22-23页 |
| ·调节膜脂组成 | 第22页 |
| ·蛋白质合成 | 第22-23页 |
| ·冷休克蛋白 | 第23页 |
| 3. 低温微生物的应用 | 第23页 |
| 三. 研究目的和技术路线 | 第23-26页 |
| 第二章 启动子探针载体的构建 | 第26-36页 |
| 1 实验材料 | 第26-28页 |
| ·菌株和质粒 | 第26页 |
| ·PCR引物 | 第26页 |
| ·主要试剂及工具酶 | 第26-27页 |
| ·实验试剂配置 | 第27-28页 |
| ·培养基的配置 | 第27页 |
| ·抗生素的配置 | 第27页 |
| ·电泳所用试剂 | 第27页 |
| ·转化所用试剂 | 第27-28页 |
| ·基因组DNA提取所用试剂 | 第28页 |
| ·主要实验仪器 | 第28页 |
| 2 实验方法 | 第28-31页 |
| ·菌种的培养 | 第28页 |
| ·载体构建 | 第28-31页 |
| ·pART2载体SP序列PCR扩增 | 第28-29页 |
| ·Amp-gfp融合基因融合PCR扩增 | 第29-30页 |
| ·扩增产物的回收 | 第30页 |
| ·回收产物与T载体连接 | 第30页 |
| ·感受态细胞的制备及连接产物的转化 | 第30页 |
| ·质粒的提取与鉴定 | 第30-31页 |
| ·构建以pART2载体为基础的缺失启动子载体pART2-SP | 第31页 |
| ·三种Amp-gfp融合基因与缺失启动子载体pART2-SP连接 | 第31页 |
| 3 结果与分析 | 第31-34页 |
| ·构建以pART2质粒为基础的缺失启动子载体pART2-SP | 第31-32页 |
| ·Amp-gfp融合基因PCR扩增 | 第32-33页 |
| ·启动子探针载体pART2-SP-Amp-gfp的构建 | 第33-34页 |
| 4 小结与讨论 | 第34-36页 |
| 第三章 启动子片段的筛选 | 第36-43页 |
| 1 实验材料 | 第36页 |
| ·菌株 | 第36页 |
| ·质粒 | 第36页 |
| 2 实验方法 | 第36-39页 |
| ·菌种的培养 | 第36页 |
| ·节杆菌基因组DNA提取 | 第36-37页 |
| ·酶切节杆菌基因组DNA和启动子探针质粒pART2-SP-Amp-gfp | 第37页 |
| ·DNA随机片段与启动子探针质粒pART2-SP-Amp-gfp酶切去磷酸化产物的连接 | 第37-38页 |
| ·启动子筛选文库电转化节杆菌 | 第38-39页 |
| 3 结果与分析 | 第39-41页 |
| ·节杆菌Arthrobacter sp.A3基因组DNA随机片段的获得 | 第39-40页 |
| ·含节杆菌基因组DNA随机片段启动子探针质粒库的构建 | 第40页 |
| ·节杆菌启动子筛选菌株库的获得 | 第40-41页 |
| 4 小结与讨论 | 第41-43页 |
| 第四章 GFP抗体制备和启动子强度测定 | 第43-56页 |
| 1 实验材料 | 第43-45页 |
| ·菌株 | 第43页 |
| ·动物材料 | 第43页 |
| ·质粒 | 第43页 |
| ·PCR引物 | 第43页 |
| ·实验试剂配置 | 第43-45页 |
| ·0.5M IPTG | 第43页 |
| ·蛋白SDS-PAGE电泳工作液 | 第43-44页 |
| ·蛋白纯化缓冲液 | 第44页 |
| ·ELISA所用试剂 | 第44页 |
| ·抗体纯化所用试剂 | 第44-45页 |
| ·Western Blot所用试剂 | 第45页 |
| 2 实验方法 | 第45-49页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第45页 |
| ·蛋白的表达与纯化 | 第45-46页 |
| ·蛋白的预诱导表达 | 第45-46页 |
| ·蛋白的大量诱导表达与镍离子亲和层析纯化 | 第46页 |
| ·抗体制备 | 第46-47页 |
| ·ELISA检测 | 第47页 |
| ·抗体纯化 | 第47页 |
| ·蛋白-Sepharose CL-6B偶联 | 第47页 |
| ·制备抗血清 | 第47页 |
| ·亲和层析过程 | 第47页 |
| ·全波长酶标仪检测 | 第47-48页 |
| ·Western Blot | 第48-49页 |
| 3 结果与分析 | 第49-54页 |
| ·GFP-His6融合蛋白的诱导表达 | 第49页 |
| ·GFP-His6融合蛋白的纯化 | 第49页 |
| ·抗体的制备 | 第49-50页 |
| ·ELISA检测抗体效价 | 第50页 |
| ·GFP多克隆抗体纯化 | 第50-51页 |
| ·全波长酶标仪初筛 | 第51-52页 |
| ·转化子Western Blot验证结果 | 第52-53页 |
| ·冷诱导启动子序列的扩增 | 第53-54页 |
| 4 小结与讨论 | 第54-56页 |
| 参考文献 | 第56-61页 |
| 在读期间的科研成果 | 第61-62页 |
| 致谢 | 第62页 |
