| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-10页 |
| 1 序言 | 第10-24页 |
| ·糖尿病 | 第10-11页 |
| ·胰岛素 | 第11-14页 |
| ·胰岛素的结构与性质 | 第11-12页 |
| ·胰岛素的一级结构 | 第11页 |
| ·胰岛素的空间结构 | 第11-12页 |
| ·胰岛素的理化性质 | 第12-13页 |
| ·胰岛素的体内合成 | 第13页 |
| ·胰岛素的生理作用 | 第13-14页 |
| ·大肠杆菌表达系统 | 第14-16页 |
| ·酵母表达系统 | 第16-17页 |
| ·分子内分子伴侣及其辅助蛋白质折叠的机制 | 第17-18页 |
| ·分子内分子伴侣的概念和分类 | 第17页 |
| ·分子内分子伴侣的结构特点 | 第17-18页 |
| ·分子内分子伴侣介导的蛋白质折叠的特点和机制 | 第18页 |
| ·重叠延伸PCR技术 | 第18-20页 |
| ·SOE PCR的原理 | 第19页 |
| ·SOE PCR的应用 | 第19-20页 |
| ·SOE PCR用于基因突变 | 第19页 |
| ·SOE PCR用来实现基因融合 | 第19-20页 |
| ·重叠延伸PCR用来合成长片段基因 | 第20页 |
| ·蛋白纯化技术 | 第20-21页 |
| ·凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) | 第20-21页 |
| ·离子交换层析(ion-exchange,IEX) | 第21页 |
| ·亲和层析(affinity chromatograph) | 第21页 |
| ·包涵体蛋白的高效复性 | 第21-22页 |
| ·本研究的立题依据 | 第22-24页 |
| ·研究目的和意义 | 第22-23页 |
| ·研究内容 | 第23页 |
| ·技术路线 | 第23-24页 |
| 2 材料与方法 | 第24-36页 |
| ·材料 | 第24页 |
| ·菌株及质粒 | 第24页 |
| ·酶及试剂 | 第24页 |
| ·实验动物 | 第24页 |
| ·方法 | 第24-36页 |
| ·hGH-双精氨酸C肽人胰岛素原基因的获取 | 第24-26页 |
| ·hGH-双精氨酸C肽人胰岛素原基因的设计与合成 | 第24-25页 |
| ·寡核苷酸片段5’端的磷酸化 | 第25页 |
| ·hGH-双精氨酸C肽人胰岛素原基因寡核苷酸片段的连接 | 第25页 |
| ·连接片段的PCR扩增 | 第25-26页 |
| ·PCR产物的回收 | 第26页 |
| ·HSA-双精氨酸C肽人胰岛素原基因的获取 | 第26-27页 |
| ·HSA基因的获取 | 第26-27页 |
| ·HSA基因PCR产物回收方法同2.2.1.5 | 第27页 |
| ·R-B-R-R-A序列的获取 | 第27页 |
| ·R-B-R-R-A基因PCR产物回收 | 第27页 |
| ·PCR产物的克隆 | 第27-28页 |
| ·PCR扩增基因片段与T载体的连接 | 第27-28页 |
| ·HSA和R-B-R-R-A基因与PET 30a载体的分步连接 | 第28页 |
| ·E.coli DH5α感受态细胞的制备(萨姆布鲁克等,2003) | 第28页 |
| ·连接产物转化感受态细胞 | 第28-29页 |
| ·重组质粒DNA的小量制备 | 第29页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第29页 |
| ·重组质粒的序列测定 | 第29-30页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第30-31页 |
| ·PET-30a表达载体的双酶切 | 第30页 |
| ·目的基因pMD18-T simple vector载体的双酶切 | 第30页 |
| ·酶切产物的回收 | 第30页 |
| ·目的基因片段与表达载体PET-30a的连接 | 第30-31页 |
| ·连接产物转化E.coli BL21(DE3) | 第31页 |
| ·重组质粒DNA的小量制备 | 第31页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第31页 |
| ·重组质粒的序列测定 | 第31页 |
| ·工程菌的诱导和表达 | 第31-32页 |
| ·菌液的SDS-PAGE分析(汪家政等,2002) | 第32-33页 |
| ·表达产物的可溶性分析 | 第33页 |
| ·包涵体蛋白的洗涤 | 第33-34页 |
| ·目的蛋白的复性 | 第34页 |
| ·双精氨酸C肽人胰岛素原的酶解与纯化 | 第34页 |
| ·Western blot鉴定 | 第34-35页 |
| ·转膜 | 第34页 |
| ·封闭及杂交 | 第34-35页 |
| ·降血糖动物模型建立及自制人重组胰岛素降血糖活性分析 | 第35-36页 |
| ·小鼠惊厥法测定生物活性 | 第35页 |
| ·自制人重组胰岛素对正常小鼠降血糖作用 | 第35页 |
| ·自制人重组胰岛素对实验性糖尿病小鼠降血糖作用 | 第35-36页 |
| 3 结果与分析 | 第36-50页 |
| ·hGH-双精氨酸C肽人胰岛素原基因的合成及扩增,HSA-双精氨酸C肽人胰岛素原基因的扩增 | 第36-38页 |
| ·hGH-双精氨酸C肽人胰岛素原基因的合成及扩增 | 第36-37页 |
| ·HSA-双精氨酸C肽人胰岛素原基因的扩增 | 第37-38页 |
| ·hGH-双精氨酸C肽人胰岛素原基因,HSA-双精氨酸C肽人胰岛素原基因的亚克隆及表达载体的构建 | 第38-40页 |
| ·hGH-双精氨酸C肽人胰岛素原基因的亚克隆及表达载体的构建 | 第39-40页 |
| ·HSA-双精氨酸C肽人胰岛素原基因的亚克隆及表达载体的构建 | 第40页 |
| ·工程菌的诱导和表达 | 第40-42页 |
| ·hGH-双精氨酸C肽人胰岛素原基因表达载体工程菌的诱导表达 | 第40-41页 |
| ·HSA-双精氨酸C肽人胰岛素原基因表达载体工程菌的诱导表达 | 第41-42页 |
| ·hGH-双精氨酸C肽人胰岛素原的两种纯化方法的比较 | 第42-44页 |
| ·hGH-双精氨酸C肽人胰岛素原的亲和层析纯化 | 第42-43页 |
| ·hGH-双精氨酸C肽人胰岛素原Sephadex G-50柱层析纯化 | 第43-44页 |
| ·hGH-双精氨酸C肽人胰岛素原酶切后的纯化 | 第44-45页 |
| ·纯化后人胰岛素的性质鉴定 | 第45-50页 |
| ·Western blot对纯化获得的人胰岛素进行免疫原性分析 | 第45-46页 |
| ·降血糖动物模型建立及自制人重组胰岛素降血糖活性分析 | 第46-50页 |
| ·小鼠惊厥法测定生物活性 | 第46页 |
| ·制备的人重组胰岛素对正常小鼠降血糖作用 | 第46-48页 |
| ·自制人重组胰岛素对实验性糖尿病小鼠降血糖作用 | 第48-50页 |
| 4 讨论 | 第50-52页 |
| ·基于前导肽的基因重组胰岛素的表达分析 | 第50页 |
| ·关于C肽的作用 | 第50-51页 |
| ·包涵体的纯化 | 第51页 |
| ·包涵体蛋白的复性 | 第51-52页 |
| ·真核基因在大肠杆菌中的表达 | 第52页 |
| ·重叠延伸PCR技术用于长片段基因的合成 | 第52页 |
| 5 结论 | 第52-53页 |
| 6 参考文献 | 第53-59页 |
| 附录1:常用培养基、试剂、缓冲液配方 | 第59-60页 |
| 1 常用培养基配方 | 第59页 |
| 2 常用试剂配方 | 第59页 |
| 3 常用缓冲液配方 | 第59-60页 |
| 附录2 | 第60-61页 |
| 1 hGH-双精氨酸C肽胰岛素原DNA序列 | 第60页 |
| 2 HSA-双精氨酸C肽胰岛素原DNA序列 | 第60页 |
| 3 根据NCBI上报道的人胰岛素原cDNA序列 | 第60-61页 |
| 4 人胰岛素的氨基酸序列如下 | 第61页 |
| 附录3:PET 30a载体图谱 | 第61-62页 |
| 致谢 | 第62页 |
