| 摘要 | 第6-8页 |
| abstract | 第8-9页 |
| 英文缩略表 | 第15-19页 |
| 第一章 引言 | 第19-35页 |
| 1.1 蛋白酶的概述 | 第19-22页 |
| 1.1.1 蛋白酶的分类 | 第19-20页 |
| 1.1.2 蛋白酶的应用 | 第20-21页 |
| 1.1.3 微生物蛋白酶的特点 | 第21-22页 |
| 1.2 天冬氨酸蛋白酶 | 第22-27页 |
| 1.2.1 天冬氨酸蛋白酶的来源与分布 | 第23页 |
| 1.2.2 天冬氨酸蛋白酶的结构特征 | 第23-25页 |
| 1.2.3 天冬氨酸蛋白酶的性质特点 | 第25-26页 |
| 1.2.4 天冬氨酸蛋白酶的催化机理 | 第26-27页 |
| 1.3 酶的热稳定性与分子改良 | 第27-33页 |
| 1.3.1 酶的热稳定性类型 | 第27-28页 |
| 1.3.2 影响酶热稳定性的因素 | 第28-30页 |
| 1.3.3 研究酶热稳定性的方法 | 第30-31页 |
| 1.3.4 酶热稳定性分子改良的策略 | 第31-33页 |
| 1.4 天冬氨酸蛋白酶的热稳定性研究进展 | 第33-34页 |
| 1.5 本研究的目的与意义 | 第34-35页 |
| 第二章 天冬氨酸蛋白酶基因的克隆表达和性质分析 | 第35-51页 |
| 2.1 实验材料 | 第35-36页 |
| 2.1.1 实验菌株和质粒 | 第35页 |
| 2.1.2 培养基 | 第35页 |
| 2.1.3 化学试剂 | 第35-36页 |
| 2.1.4 引物合成与核酸测序 | 第36页 |
| 2.2 实验仪器 | 第36页 |
| 2.3 实验方法 | 第36-43页 |
| 2.3.1 菌株培养 | 第36页 |
| 2.3.2 真菌基因组DNA的提取和c DNA的获取 | 第36-37页 |
| 2.3.3 引物设计与目的基因扩增 | 第37-38页 |
| 2.3.4 表达载体的构建 | 第38页 |
| 2.3.5 天冬氨酸蛋白酶基因的异源表达 | 第38-40页 |
| 2.3.6 重组天冬氨酸蛋白酶的浓缩与纯化 | 第40页 |
| 2.3.7 蛋白含量的测定 | 第40-41页 |
| 2.3.8 天冬氨酸蛋白酶的性质分析 | 第41-43页 |
| 2.4 结果与分析 | 第43-48页 |
| 2.4.1 天冬氨酸蛋白酶基因克隆和序列分析 | 第43-44页 |
| 2.4.2 天冬氨酸蛋白酶的表达和纯化 | 第44-45页 |
| 2.4.3 天冬氨酸蛋白酶的酶学性质分析 | 第45-47页 |
| 2.4.4 天冬氨酸蛋白酶应用于果汁澄清 | 第47-48页 |
| 2.5 讨论 | 第48-50页 |
| 2.6 本章小结 | 第50-51页 |
| 第三章 天冬氨酸蛋白酶Tl APA1 的酶原激活 | 第51-62页 |
| 3.1 实验材料 | 第51页 |
| 3.1.1 实验菌株和质粒 | 第51页 |
| 3.1.2 培养基 | 第51页 |
| 3.1.3 化学试剂 | 第51页 |
| 3.1.4 引物合成与核酸测序 | 第51页 |
| 3.2 实验仪器 | 第51页 |
| 3.3 实验方法 | 第51-53页 |
| 3.3.1 不同表达载体的构建 | 第51-52页 |
| 3.3.2 天冬氨酸蛋白酶的重组表达 | 第52页 |
| 3.3.3 蛋白含量测定 | 第52页 |
| 3.3.4 天冬氨酸蛋白酶酶原激活过程分析 | 第52-53页 |
| 3.3.5 天冬氨酸蛋白酶酶原激活前后酶学性质分析 | 第53页 |
| 3.3.6 天冬氨酸蛋白酶多序列比对与进化分析 | 第53页 |
| 3.3.7 蛋白的N端测序 | 第53页 |
| 3.4 结果与分析 | 第53-59页 |
| 3.4.1 天冬氨酸蛋白酶Tl APA1 的酶原表达 | 第53-54页 |
| 3.4.2 天冬氨酸蛋白酶Tl APA1 的酶原激活 | 第54-55页 |
| 3.4.3 pH对酶原激活的影响 | 第55-56页 |
| 3.4.4 蛋白水解活性对酶原激活的影响 | 第56-57页 |
| 3.4.5 Tl APA1 酶原激活前后酶学性质的比较 | 第57-58页 |
| 3.4.6 Tl APA1 独特的自我激活方式及原因分析 | 第58-59页 |
| 3.5 讨论 | 第59-61页 |
| 3.6 本章小结 | 第61-62页 |
| 第四章 Bs APA晶体结构解析和热稳定性突变研究 | 第62-78页 |
| 4.1 实验材料 | 第62页 |
| 4.1.1 质粒和菌株 | 第62页 |
| 4.1.2 培养基和溶液 | 第62页 |
| 4.1.3 化学试剂 | 第62页 |
| 4.1.4 引物合成与核酸测序 | 第62页 |
| 4.2 仪器设备 | 第62页 |
| 4.3 实验方法 | 第62-67页 |
| 4.3.1 Bs APA晶体结构解析 | 第62-63页 |
| 4.3.2 突变位点的选择 | 第63-64页 |
| 4.3.3 Bs APA突变体的构建 | 第64-66页 |
| 4.3.4 表达载体的构建与转化 | 第66页 |
| 4.3.5 重组蛋白的表达与纯化 | 第66页 |
| 4.3.6 蛋白含量的测定 | 第66页 |
| 4.3.7 Bs APA突变体的酶学性质分析 | 第66-67页 |
| 4.4 结果分析 | 第67-75页 |
| 4.4.1 Bs APA蛋白结晶与结构解析 | 第67-70页 |
| 4.4.2 Bs APA突变体的设计 | 第70-72页 |
| 4.4.3 Bs APA突变体蛋白的表达与纯化 | 第72-73页 |
| 4.4.4 Bs APA及突变体的酶学性质分析 | 第73-75页 |
| 4.5 讨论 | 第75-77页 |
| 4.6 本章小结 | 第77-78页 |
| 第五章 Bs APA高温自切割对其热稳定性的影响 | 第78-90页 |
| 5.1 实验材料 | 第78页 |
| 5.1.1 实验菌株和质粒 | 第78页 |
| 5.1.2 培养基 | 第78页 |
| 5.1.3 化学试剂 | 第78页 |
| 5.1.4 引物合成与核酸测序 | 第78页 |
| 5.2 实验仪器 | 第78页 |
| 5.3 实验方法 | 第78-81页 |
| 5.3.1 Bs APA目的蛋白的表达纯化 | 第78-79页 |
| 5.3.2 Bs APA的自切割研究 | 第79页 |
| 5.3.3 Bs APA的切割位点的确定 | 第79页 |
| 5.3.4 Bs APA突变体的设计与构建 | 第79-80页 |
| 5.3.5 载体的构建与转化 | 第80页 |
| 5.3.6 重组蛋白的表达与纯化 | 第80页 |
| 5.3.7 蛋白含量的测定 | 第80页 |
| 5.3.8 Bs APA突变体的酶学性质分析 | 第80-81页 |
| 5.3.9 Bs APA野生型和突变体的热稳定性分析 | 第81页 |
| 5.4 结果与分析 | 第81-87页 |
| 5.4.1 Bs APA的高温自切割 | 第81-84页 |
| 5.4.2 突变位点的选择 | 第84页 |
| 5.4.3 Bs APA突变体的构建与筛选 | 第84-85页 |
| 5.4.4 Bs APA突变体的表达和纯化 | 第85-86页 |
| 5.4.5 Bs APA突变体的Tm和自切割分析 | 第86页 |
| 5.4.6 Bs APA突变体的比活和酶学动力学 | 第86-87页 |
| 5.5 讨论 | 第87-89页 |
| 5.6 本章小结 | 第89-90页 |
| 第六章 全文结论 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-101页 |
| 附录 | 第101-103页 |
| 致谢 | 第103-104页 |
| 作者简历 | 第104-105页 |
