| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| PartⅠ Plac9 基因的克隆及功能初探 | 第13-42页 |
| 第一章 绪论 | 第13-19页 |
| 1.1 分泌蛋白 | 第13-14页 |
| 1.1.1 概述 | 第13页 |
| 1.1.2 经典途径的分泌蛋白 | 第13-14页 |
| 1.1.3 非经典途径的分泌蛋白 | 第14页 |
| 1.2 胚胎发育以及Plac9蛋白 | 第14-17页 |
| 1.2.1 人类胚胎发育简介 | 第14-16页 |
| 1.2.2 胎盘特异性分泌蛋白简介 | 第16-17页 |
| 1.2.3 Plac9蛋白的发现 | 第17页 |
| 1.3 本文构思 | 第17-19页 |
| 1.3.1 选题缘由 | 第17页 |
| 1.3.2 研究内容 | 第17-18页 |
| 1.3.3 研究目的及意义 | 第18-19页 |
| 第二章 实验材料、仪器和试剂 | 第19-23页 |
| 2.1 实验材料 | 第19页 |
| 2.1.1 实验细胞 | 第19页 |
| 2.2 实验仪器和耗材 | 第19-20页 |
| 2.2.1 实验仪器 | 第19-20页 |
| 2.2.2 实验耗材 | 第20页 |
| 2.3 实验试剂 | 第20-21页 |
| 2.4 溶液配制 | 第21-23页 |
| 2.4.1 质粒转化所需培养基 | 第21页 |
| 2.4.2 细胞生理溶液 | 第21-22页 |
| 2.4.3 Westernblotting所需试剂 | 第22-23页 |
| 第三章 实验方法 | 第23-33页 |
| 3.1 Plac9的生物信息学分析 | 第23页 |
| 3.2 质粒的构建 | 第23-27页 |
| 3.2.1 提取pCMV-3tag-8的质粒 | 第23页 |
| 3.2.2 构建pCMV-3tag-8-Plac9载体 | 第23-27页 |
| 3.2.2.1 trizol法提取RNA | 第23-24页 |
| 3.2.2.2 将RNA反转录为cDNA | 第24页 |
| 3.2.2.3 扩增Plac9的ORF | 第24-25页 |
| 3.2.2.4 PCR产物清洁 | 第25页 |
| 3.2.2.5 回收的PCR产物和pCMV-3tag-8双酶切 | 第25-26页 |
| 3.2.2.6 连接 | 第26页 |
| 3.2.2.7 转化 | 第26页 |
| 3.2.2.8 菌落PCR | 第26-27页 |
| 3.2.2.9 用同样的方法构建载体 | 第27页 |
| 3.3 细胞培养以及细胞转染 | 第27-28页 |
| 3.3.1 细胞复苏 | 第27页 |
| 3.3.2 细胞培养 | 第27页 |
| 3.3.3 细胞传代 | 第27-28页 |
| 3.3.4 细胞转染 | 第28页 |
| 3.3.5 细胞冻存 | 第28页 |
| 3.4 免疫荧光以及激光共聚焦显微镜 | 第28-29页 |
| 3.4.1 免疫荧光 | 第28-29页 |
| 3.4.2 激光共聚焦显微镜的使用 | 第29页 |
| 3.5 荧光定量PCR | 第29-30页 |
| 3.6 构建稳定过表达Plac9的细胞系 | 第30-31页 |
| 3.6.1 过表达慢病毒载体的制备 | 第30页 |
| 3.6.2 Lentivirus慢病毒包装 | 第30页 |
| 3.6.3 病毒的收获以及浓缩 | 第30页 |
| 3.6.4 Lentivirus滴度测定 | 第30-31页 |
| 3.7 MTT以及克隆形成实验 | 第31页 |
| 3.7.1 MTT实验 | 第31页 |
| 3.7.2 克隆形成实验 | 第31页 |
| 3.8 流式分析检测Plac9对细胞周期的影响 | 第31-32页 |
| 3.9 Westernblotting | 第32-33页 |
| 3.9.1 总蛋白的提取 | 第32页 |
| 3.9.2 Westernblotting具体步骤 | 第32-33页 |
| 第四章 Plac9分泌到细胞外抑制增殖 | 第33-36页 |
| 4.1 生物信息学分析 | 第33-34页 |
| 4.1.1 引言 | 第33页 |
| 4.1.2 Plac9的基因结构、疏水性、信号肽以及蛋白结构的预测 | 第33-34页 |
| 4.2 Plac9的亚细胞定位和分泌途径 | 第34-36页 |
| 4.2.1 引言 | 第34页 |
| 4.2.2 实验结果 | 第34-36页 |
| 4.2.2.1 pCMV-3tag-8-Plac9(CSH、TRX)载体的构建 | 第34页 |
| 4.2.2.2 免疫荧光细胞共定位 | 第34-36页 |
| 第五章 过表达Plac9抑制细胞的增殖 | 第36-40页 |
| 5.1 引言 | 第36页 |
| 5.2 实验结果 | 第36-40页 |
| 5.2.1 Plac9在各肝细胞系中的表达谱并构建过表达细胞系 | 第36-37页 |
| 5.2.2 Plac9能影响细胞的增殖 | 第37页 |
| 5.2.3 Plac9能影响细胞的周期 | 第37-39页 |
| 5.2.4 过表达Plac9影响了G2/M期相关的周期蛋白的表达 | 第39页 |
| 5.2.5 进一步证明Plac9蛋白分泌到细胞外并抑制细胞增殖 | 第39-40页 |
| 第六章 讨论 | 第40-42页 |
| PartⅡ Plac9基因敲除细胞系的建立及鉴定 | 第42-55页 |
| 第一章 前言 | 第42-45页 |
| 1.1 概述 | 第42页 |
| 1.2 基因敲除技术 | 第42-43页 |
| 1.2.1 概述 | 第42-43页 |
| 1.3 本文构想 | 第43-45页 |
| 第二章 利用CRISPR/Cas9技术敲除PLAC9基因 | 第45-53页 |
| 2.1 引言 | 第45页 |
| 2.2 实验材料 | 第45-47页 |
| 2.2.1 实验试剂 | 第45-46页 |
| 2.2.2 实验仪器 | 第46-47页 |
| 2.3 实验方法 | 第47-49页 |
| 2.3.1 sgRNA寡核苷酸链序列的设计 | 第47页 |
| 2.3.2 PX458-sgRNA表达载体的构建和鉴定 | 第47-48页 |
| 2.3.2.1 提取PX458质粒 | 第47页 |
| 2.3.2.2 酶切质粒PX458 | 第47页 |
| 2.3.2.3 将酶切好的体系切胶回收,并检测回收产物的浓度 | 第47页 |
| 2.3.2.4 退火 | 第47-48页 |
| 2.3.2.5 连接 | 第48页 |
| 2.3.2.6 转化 | 第48页 |
| 2.3.2.7 将长出来的单克隆做菌落PCR检测,测序并确认构建成功。.. | 第48页 |
| 2.3.3 细胞培养和细胞转染 | 第48-49页 |
| 2.3.4 流式细胞仪分选 | 第49页 |
| 2.3.5 单细胞培养 | 第49页 |
| 2.3.6 测序检测 | 第49页 |
| 2.3.7 Westernblot检测敲除效率 | 第49页 |
| 2.4 实验结果 | 第49-53页 |
| 2.4.1 sgRNA的设计 | 第49-50页 |
| 2.4.2 载体的构建 | 第50-51页 |
| 2.4.3 细胞转染 | 第51页 |
| 2.4.4 流式分选 | 第51页 |
| 2.4.5 错配酶检测 | 第51-52页 |
| 2.4.6 测序结果 | 第52页 |
| 2.4.7 WB检测 | 第52-53页 |
| 第三章 讨论与展望 | 第53-55页 |
| 参考文献 | 第55-59页 |
| 致谢 | 第59-60页 |
| 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文目录 | 第60页 |
